GB_T 44342-2024 苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法.docx

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1、ICS65.020.20CCSB16侬中华人民共和国国家标准GB/T443422024苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofDidyme1.1.ag1.onerata(Corda)QianChen&1.Cai如25-03-01实施2024-08-23发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会前言m1范用I2规范性引用文件I3术语和定义I4苏帙叶枯病前基本信息I5方法原理I6试剂、材料和培养基I6.1 试剂和材料I6.2 培养基27仪器和用具21.1 仪器21.2 用具28 检疫将定方法28.1 病害磷28.2 病原由分离培养和形态帑定28.3 分子生

2、物学鉴定39 结果判定310样品和档案保存39.1 1样品保存与处理39.2 2阈株保存与处埋39.3 3结果记录与资料保存附录A（资料性）苏铁叶枯病菌的其他信息A.1病害情近A.2寄主范HiA.3分布范围A.4传播方式A.5病害症状A.6病原菌形态特征7附录B（资料性）苏快叶枯病培养茶配5方法10B1.马曾，由（PDA）培养基10B.2燕麦片琼胶（OA）培养基10附录C（资料性）苏铁叶枯病菌DNA提取11C.1.DNA提取方法（改良CTAB提取法）11C2DNA施与定11附录D(规范性)苏铁叶枯病菌实时荧光PCR检测方法D.I引物和探针序列D.2实时灵光体系D3结果判定附录E(MStt)苏铁

3、叶枯病-B微管蛋白hib2片段PCR扩增方法E.1引物序列E2PCR体系及MXMI1.-JuK.-A-刖三本文件按照GB1.1-2020标戊化工作导则第1分：标戊化文件的雄构和HUO的规请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识JM专利的贵任.本文件由全国植物检疫标准化技术委员会SACC271）提出并归口.本文件起”位，中国检3检疫科学研烟、中国科学院微生物研文所、湿加仙湖植物园、宁波海Y:技术中心、II建省皓Im蝌学研究所、西鼻自治区褥*生物研究所.本文件主要起草人：刘芳、黄英、程m、*.徐聆、段维军、蔡江桥、罗金水、王、产进、IMi多吉I1.1.苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法1

4、范B1.本文件描述了苏铁叶枯病菌(Didymdk1.gkmcea)的分离培养,形态学鉴定、分子牛.物学鉴定方法.本文件适用于植物及其产品中苏铁叶枯病徵的徐杳格定。2祝范性引用文件本文件没有规范性引用文件.3本文件没E1界定的术语和定义.4苏的傩gtMTJB学名:DidynM1.IagIanwru1.a(Corda)QkmChenA1.Cai舁fi：Cotuothyriumg1.omeraumCordaJcon.Fungonn(Prague:39.184().Aposp1.iaeriag!omeraUitCorda)Sacc.Sy1.1.Fmg.(Ahe1.1.ini)3:175,1884.Ph

5、Omag1.onerata(Corda)Vo1.1.enw.WViEVb)反.BBA.6在PDA培养蓦上培养14d的常彩必用a)M正b)反A.7在OA靖葬修上靖葬14的“彩杰BBBA.8分生范子GIVT4454221）24Ha.9分生用于地（来源：Va1.eftZueIaJXipez等，2018）OA.10JW病于n.产IUUMa分生相子三.12分生范于附录B(MMtt)8.1 马得IRmQK(PDA)培养基称取去皮马竹普20g.切片，加适fit蒸溜水煮沸15min-20nun,双层纱布过流,在注液中加入蒯药桶20R、琮脂粉17g,加蒸帼水补足至100omI“12】C高压灭的20min.8.2

6、 兼麦片琼威(OA)埼养苔燕麦片30gtt1.水100OIii1.,煮沸15min20min.用纱布过滤后补足乐至IoMm1.,加入琼脂粉7g,121,C高乐灭菌20min.附录。（资料性）苏铁叶枯病菌DNA提取C.1.DNA棍取方法（改良CTAB提取法）提取步探如Ra）取适球甫丝体或病有组织样本（500mg）和火徵的破瑞珠放在2n1.离心管中，加入500u1.2xCTAB（60C）.置于组织破碎仪上破碎组织细胞琏,水浴保温30mm60min.偶尔振荡混匀：b）加入5001.（k1.等体积三氯甲烷/异戊碑（24:1）.上下翻转离心管.混匀.12000nminJ心15min;C）提取上清液，加入

7、等体枳的三氯甲烷/异戊醉（24:1）,上下翻转离心管，混匀，12000Mmin离心15min;Hi%此步骤一次：提取上清液，加入等体积异内醉，上下轴依离心管，混匀，沉淀30nin:c）12（XMk,1.min黑心10min:O弃去液相，加入400p1.70%乙醉，轻微振荡洗涤，12000rmin离心5min;垂现此步骤一次；g）弃去液相，园净工作台内干燥DNA,约20min;h）加入501.或IoQ1.i1.双蒸水（视情况而定）溶解DNA样品，将样品于-20C保存;JC.2DNA纯度与浓度的测定用核酸蛋白检测仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nrnf1.28Onm处的吸光值，计.核酸的纯

8、度和浓度，按照公式（CD计算DNA纯度，按照公式（C.2）计算DNA质琏浓度：C=50OD260C2)式中：cone.DN纯度CDNA成域浓度,单位为战克绿意升（M0m1.）;OD260K酸在260nm的吸光值：OO,No蛋白质在280nm的吸光值.PCR级DNA溶液的ODz60与OD280的比值应为1.77.9。(M范性)苏铁叶枯实时要光PcK栩N方法M引检和探针序列引物DGFJDGR和TaqMan-MGBHIXiP的序列见衣D.I.M1.如恒光PeR引物序列和舞针引物和探针序列(5-g)DGF5,-TGCATrGCGCTcGCTGTA-3I)GR5-GGGCGACCfiACAATGGATD

9、GP5-FM-TGAGAAaCACnTCTGACAAA-MGBTD.2实时灵光P(R反应体系反应体系：0.2m1.离心管中加入2XTagMdnuniversa1.PCRMas1.CTMix1.01.,DGF(0.6mo1.1.),DGR(0.6mo1.1.)各1.2U1.探针DGP(0.6moH1.)1.21.,疑似菌株或钛似病害组织样本的DNA模板1U1.,补水至20I.,以苏铁叶枯病菌的DM或含有目标片段的合成质粒作阳性对照、不含苏帙叶枯病苗的Dw作阴性对照、以无带施储水作空白时照。将反应体系混合均匀后咒下荧光PCR仪中诳行反应.反应程序：9110min.94r5s,60,C60s,40个

10、循环。注.PCR反应体耒中各i剂的M根据具体情况送行适当训整,0.3ttJV在阴性对照和空白对照无C1.值且无扩增曲戏,阳性对照C1.值W30并出现典型扩埴曲线的条件卜：待测样品。值NK)时,判定为苏铁叶枯病菌阴性：仲刈样篇C1.ftW35,且出现典型的犷剧曲税,判定为苏铁叶枯病菌阳性-待测样品。值在35FO之间时,重新测试：增加DNA用业2倍10倍再次测试,待测样品出现典里扩增曲戌，且CtfftW35,判定为芥铁叶祜稳苗阳性；否则判定为阴性，苏铁叶枯白tub2片段PeRIntt方法E.1引物序引里物序列见表E。*E.1IMtPCR扩引物目标基因引物名称序列(5-3)扩增片段tub2tub2f

11、d5-CTBCAa1.YCARA(XGGYCARTG-3343bp左右tub4rd5-CCRGYTGRCCRMRCR)bG11GTC-3E.2PCR反应体系及金E.2.1PCRMjfi体以25U1.为例：0.2疝离心管中加入2XTaqPCRMasterMix12.5U1.正向引物1.ub2fd(10UmO1.儿)和反向引物1.ub4rd(10Uo1.D1.M1.,DX.A模板IU1.dd1.M)9.51.E.2.2PCR反应程序PCR反应程序见表E.2.*E2PCR反应程序步界RAC时一Wfftt预变性955minI变性9530835地火52308城仲72IninIf伸72IOninIE.2.

12、3MMttI阳性对照；以苏铁叶枯衲苗的DNA样品或含有目标片段的合成侦粒为阳性对照，阴性对照：以健般寄主植物IKR为阴性对照，空白对照：以无两双蒸水代苗DM模板.e.2.4m利用表E.I中的引物对，对上述PCR产物诳行序列测定.E.2.5DNAJ利用MEGA软件或其他序列分析软件，对测序狭褥的双向峥图文件（后级名.ABD进行拼接。为确保序列可靠性,首先对测序质量进行评估（如是否有杂螃、是否双峰、长度是否与目的条带吻合等),然后去除双向测序结果两端峰形杂乱的低质量序列，再将利用反向引物1.ub4n1.测得的序列进行反向互补，最后拼接得到可就的结果序列.E.2.6B1.ASTia果分析将待测样M序

13、列与已知序列进行相似度比对若B1.AST结果显示待测样M序列与已知的苏铁叶枯(1.)idymeUafkneru或其同物异名Perone1.1.aeag1.oertM.P1.umtagkmerata的序列相似性达99%以上，与其他物种相似性小于99%,可判定为苏铁叶枯病雨.考文献郭立新，段丽君，王英超，段维军.基于TaqgMmMGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光KR检测方法4.植物病理学报,2020.50(1):97-106.2段维军，顾建锋,张恕丽,陈先锋&吴品珊.进境意大利苹果苗上却萄茎枯病曲的截获鉴定U1.植物病理学报,2014t44(5):542-545.|3)Faraz.A.,1.atif

14、.M.Z.&YaNeen.O.(2O2O).Funj;a1.diseasesofKangiPa1.m(CyeaSrc-vo1.u1.a).InU1.HaqI.&1.jazS.(Edsa)wE1.io1.ogyandintegratedmanagementofeconomica1.1.yimportantfunga1.diseasesofornamenta1.pa1.11s(pp.265-274).Springer.4Hou.1.w.Groenewa1.dJ.Z.Pfenning.1.H.Yarden0.Crous.P.W,CaiX.(2O2O).Thcphnma-1.ikcdi1.emma.S

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