GB_T 44342-2024 苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法.docx

ICS65.020.20CCSB16侬中华人民共和国国家标准GB/T443422024苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofDidyme1.1.ag1.onerata(Corda)QianChen&1.Cai如25-03-01实施2024-08-23发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会前言m1范用I2规范性引用文件I3术语和定义I4苏帙叶枯病前基本信息I5方法原理I6试剂、材料和培养基I6.1 试剂和材料I6.2 培养基27仪器和用具21.1 仪器21.2 用具28 检疫将定方法28.1 病害磷28.2 病原由分离培养和形态帑定28.3 分子生物学鉴定39 结果判定310样品和档案保存39.1 1样品保存与处理39.2 2阈株保存与处埋39.3 3结果记录与资料保存附录A（资料性）苏铁叶枯病菌的其他信息A.1病害情近A.2寄主范HiA.3分布范围A.4传播方式A.5病害症状A.6病原菌形态特征7附录B（资料性）苏快叶枯病培养茶配5方法10B1.马曾，由（PDA）培养基10B.2燕麦片琼胶（OA）培养基10附录C（资料性）苏铁叶枯病菌DNA提取11C.1.DNA提取方法（改良CTAB提取法）11C2DNA施与定11附录D(规范性)苏铁叶枯病菌实时荧光PCR检测方法D.I引物和探针序列D.2实时灵光体系D3结果判定附录E(MStt)苏铁叶枯病-B微管蛋白hib2片段PCR扩增方法E.1引物序列E2PCR体系及MXMI1.-JuK.-A-刖三本文件按照GB"1.1-2020标戊化工作导则第1分：标戊化文件的雄构和HUO的规请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识JM专利的贵任.本文件由全国植物检疫标准化技术委员会SAC"C271）提出并归口.本文件起”位，中国检3检疫科学研烟、中国科学院微生物研文所、湿加仙湖植物园、宁波海Y:技术中心、II建省皓Im蝌学研究所、西鼻自治区褥*生物研究所.本文件主要起草人：刘芳、黄英、程m、*«.徐聆、段维军、蔡江桥、罗金水、王、产进、IMi多吉I1.1.苏铁叶枯病菌检疫鉴定方法1范B1.本文件描述了苏铁叶枯病菌(Didymdk1.gkmcea)的分离培养,形态学鉴定、分子牛.物学鉴定方法.本文件适用于植物及其产品中苏铁叶枯病徵的徐杳格定。2祝范性引用文件本文件没有规范性引用文件.3本文件没E1界定的术语和定义.4苏的傩gtMTJB学名:DidynM1.IagIanwru1.a(Corda)QkmChenA1.Cai舁fi：Cotuothyriumg1.omeraumCordaJcon.Fungonn(Prague:39.184().Aposp1.iaeriag!omeraUitCorda)Sacc.Sy1.1.Fmg.(Ahe1.1.ini)3:175,1884.PhOmag1.on>erata(Corda)Vo1.1.enw.<Hochapfe1.fcZ.Parasiienk,3(5):592.1936.Pcyronc1.1.acag1.omcrata(CordaKjoid.cxTogiiani.Ann.Spcrim.Agnir.i1.16:93.1952.中文学名：团儿亚隔抱壳中文异名：匍出茎枯病茵分类堆位工真菌界FUngi,子囊南“Assmycoia,座囊菌纲DZhidcOmyedes,格他腔齿目P1.eoWora1.es.亚隔胞壳科DidymCHdCeaC.亚隔他光MDidymdkU苏铁叶枯病菌与q.随他壳属中其他物种的形态特征相似,难以单纯依旅形态特征进行区分.近缘种包括Dxmserina、D.aureayDjmisae等。苏铁叶枯病值的其他信息见附录A。5根据病害症状、分离菌的形态特征(见附录A).以及实时荧光聚合熊链式反应(PCR)检冽方法或B微管蛋白tub2序列特征对芥铁叶枯病他进行依祗帑定，6 m.tmra三除有特殊说明外，所有试脸用试剂均为分析纯或生化试剂，分离培养所需试剂和材料：马铃磐、燕麦片、蒸馈水、的豺的、琼1|胧八次氯殿钠、73k醉、无菌水。提取DNA所能试剂或相应的DNA提取试剂盒：十六烷禁三甲基渔化镣(CTAB)提取缓冲液2%CTAB,1.4mob'1.NaCI.20mmoU1.乙二胺四乙酸(EDTAh1.(K)mmo1./1.TrisHCIpH8.0,三氯甲烷、异戊醉、异丙醉、70乙酹'无菌双蒸水.实时荧光PCR所露试剂:2XTagManUniversa1.PCRMasterMix、无菌双蒸水.伴通PCR和电泳所需试剂：2XTaqPCRMasterMix(含PCR缓冲液、dNTPs,Taq聚合物、MgCI2)x无薄双蒸水、D1.2000DNAMarker,琼脂糖、GeIRed核酸染料.6.2培养苔马性寓葡荀精琼脂(PDA)培笄基，燕麦片琮胶(OA)培养基，具体配方见附录B.7仪和用具7.1 ft体视烧、显微f(放大倍数IOC1.倍以上八培养箱、高压灭帝器、超净工作台,组织破碎仪、忸温水浴辆、惠心机、电子天平、超纯水仪、泡涡振锵器、冰箱、微屈移液器S5p1.,2.5p1.IO1.201.,2001.,1.OOO1.).实时荧光PCR仪、常规PCR仪、凝胶电泳仪，7.2 用具培养皿、纱布、泄纸、泗精灯、批筒、烧杯.银于、载破片、盖玻片、玻璃珠.吸头、离心管(2m1.),PCR管(0.2m1.)等.8观察有无叶枯、茎枯、枯:嚣、叶殂、坏死等症状(见附录A),利用手持放大镣在部分患初依物组织上可见浅棕色至深棕色或黑色的小斑点.即分生池子湍.如发现可疑症状,取受害部位进行分离培养。&2*«分2即3定a2.1采用PDA培养基用于病原菌的分离和曲种保存，将坏死和健康交界处发病组织剪成4mm»-9rm的小块，依次在75%乙醇中消毒30s、5%次氯酸咕溶液中消毒90s,然后用无阳水冲洗3次，灭黄沌纸吸干水分后放区在PDA培养基上，将平皿放置在25C培养箱中培养31175挑取疑似阳落边缘的缁丝,转接至PDA或OA培养基上，25'C培养7d.必要时枭用12h光照/12h近紫外光周期性照射以便进分生泡子器的形成.8.Z2ffHM调落特征：花PDA培养基上，7d后菌落史径76mm78mm.曲落正面烟灰色，气生隅丝物状'白色或灰色：菌落背而白得灰色至灰橄检色.在OA培养基上.7d后菌落直径70mm.菌落正面烟灰色至灰色橄榄色，气生菌丝绒毛状、白色至灰色，的落表面可见黑色分生抱子器和玫瑰色分生胞子堆：能落背面浅网灰色。显微特征：分生胞子器毕生或聚生.球形或近球形，直径10011r-300m无毛，表牛城半埋生，具乳突，孔口1个3个.分生胞子器器喷拟薄壁加织状，由4层'7层等柏细胞组成，外层细胞粽色.腌视产抱，无色透明，光滑，多为安液状，有时近球形，（3.59ux（4'8）u。分生例子长Ia形至B1.柱形，有时期If1.I形或倒卵形，无色透明，光滑.壁薄，无分隔，（4.5'6.5）n×（2'3）Ua（平均值=5.7MmX23Um）,部分抱子具油滴，原坦泡子褐色，顶生，通常为2个'20个或更多的分枝或不分枝微，最初光滑，后来变粗糙，（1880）nM1235）m,形态特征见A.6,&38.3.1D、Am采用票因组提取试剂盒制备DNA,或采用改良的CTAB提取法（见附录O，832实时要光PCR检焉采用实时荧光PCR特异性引物DGF/DGR和TaqMaM擀1.DGP.按照附录D对疑似苗株或疑似病害组织样本进行实时荧光PCR检测.&&3利用tub2片段的通用引物对疑似储株DNA诳行扩增，测序后，将序列在国际权威数据库进行比对.与国际权威数据库中苏铁叶枯病菌的序列进行相似性分析,分析方法按照附录E.9期初健病害症状和分离物的形态特征分别与8.I和8.2描述的一致，旦实时荧光PCR检测结果为阳性或1.ub2序列与国际权或数据库中苏铁叶枯病曲序列相似性大于993可判定检出苏铁叶枯病曲。10祥品和植案保存样品经登记和经手人签字后妥释保存,对检出苏铁叶枯新曲的样品应保存于4C冰箱中，以符雯核，保存期满后需经高代灭菌后方可处理.10.2株保存与处理从检测样品中分离并签定为苏铁叶枯病曲的常株，应妥善保存.将儡种转入PDA斜面和装有灭曲蒸懒水的冻存管,保存于4T冰箱中,至少保存6个月以各更核.保存期满后高压灭活处理.IQ3第累记录与费科保存完整的试验记录包括：样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法和结果等,并要有试验人员和审核人员签字.序列JT地应有测序结果文件，实时荧光PCR检测应有检测结果照片。相关资料保存6个月以上.(KMtt)苏制M1.的其他息A.1病害情况苏铁叶枯病由DidymeMag1.omemta(中文学名:团集亚隔抱壳；中文异名：一奇茎枯病0是造成植物叶枯、茎枯、坏死或枯茬等症状的主要病原真曲之一，严双影响植物的生长发H,共至峥致值株死亡.A.2主范B1.经济作物：蚕豆(ViCiafaba)、大豆(G1.yCinemax)、大麦(HordeUmVU1.gare)、甘赧M(Sacchnfus11sp.).开心果(PiStaCiHVern)、马的薯(SoIHnUBJtUberoSw)、小麦(TritieuIIiaeStiVUso)、磁奏属(Avenasp.).水枭：果石榴(PWidiUngUajav)、柑橘水(CitrUSSpp.)、荔枝M(1.itehispp.),一果属(MaI1.US卬.)、葡荷科(Viu1.CCac)、W1.W(Amygda1.ussp.)、吞(ArmCniaCaVU1.gari$)、中华册猴桃(Actin-idiacinensish其他植物；橄榄属(CanI1.riUesp.)、花旗松(PSCUdO1.SUftamenziesiD、蓝花椎属(JaCaraUdiisp.?»梨果仙人拿(gvntiaficus-indic)、(Medicsgosp.)、1.,(Roserugose),由茶萸(Co11nusOtkina1.is),梅香版(Santa1.Umsp.),橡皮树(MCUSC1.aMiCa)、杨属(POPU1.uSsp.),株相应(TiwhycarpusSPJ.此外.该病原菌还可侵染人体、动物,或存活于土填中.AJ分布范B1.大泮洲：澳大利亚、巴布亚新几内亚、新西兰.非洲：津巴布韦、肯尼亚、马拉维、坦桑尼亚、酎比亚美洲：巴西、加拿大、美国、墨西哥。欧洲：波兰、决国、俄罗斯、荷兰、立陶宛、玻典'土耳其、西班牙、希腊、匈牙利.亚洲：巴基斯坦、马来西亚、缅甸、沙特阿拉伯、伊朗、印度、中国(零星分布：河南省南阳市西帔县、浙江省温州市秦城县).A.4传播方式近距离主要由媒介昆虫和雨水滴溅等方式传播，远距离主要通过带病植株和繁殖材料传播，AS««««苏柳叶枯病造成的植物痫害症状见图1.BBA6.（来源：NayabandAkhtar.2016）BBAj芳快m状（来源：1.aUrean（AAhUdkin等，2021）BA.2IKJMh人掌状（来源：Mgi等，2018）Baj开心果»«（来源：Rmi等，2018）bba.4薄事豕m状B3大«状苏铁叶怙加茵对加梭式由祗CBS528.66的形态行祉见图A.6-图A.12.a>WViEVb)»反.BBA.6在PDA培养蓦上培养14d的常彩必用a)M正b)»反A.7在OA靖葬修上靖葬14«的“彩杰BBBA.8分生范子GIVT4454221）24Ha.9分生用于地（来源：Va1.eftZueIaJXipez等，2018）OA.10JW病于n.产IUUMa分生相子三.12分生范于附录B(MMtt)8.1 马得IRmQK(PDA)培养基称取去皮马竹普20g.切片，加适fit蒸溜水煮沸15min-20nun,双层纱布过流,在注液中加入蒯药桶20R、琮脂粉17g,加蒸帼水补足至100omI“12】C高压灭的20min.8.2 兼麦片琼威(OA)埼养苔燕麦片30gtt1.水100OIii1.,煮沸15min20min.用纱布过滤后补足乐至IoMm1.,加入琼脂粉7g,121,C高乐灭菌20min.附录。（资料性）苏铁叶枯病菌DNA提取C.1.DNA棍取方法（改良CTAB提取法）提取步探如Ra）取适球甫丝体或病有组织样本（500mg）和火徵的破瑞珠放在2n1.离心管中，加入500u1.2xCTAB（60C）.置于组织破碎仪上破碎组织细胞琏,水浴保温30mm60min.偶尔振荡混匀：b）加入5001.（k1.等体积三氯甲烷/异戊碑（24:1）.上下翻转离心管.混匀.12000n'minJ心15min;C）提取上清液，加入等体枳的三氯甲烷/异戊醉（24:1）,上下翻转离心管，混匀，12000Mmin离心15min;Hi%此步骤一次：提取上清液，加入等体积异内醉，上下轴依离心管，混匀，沉淀30nin:c）12（XMk,1.min黑心10min:O弃去液相，加入400p1.70%乙醉，轻微振荡洗涤，12000rmin离心5min;垂现此步骤一次；g）弃去液相，园净工作台内干燥DNA,约20min;h）加入501.或IoQ1.i1.双蒸水（视情况而定）溶解DNA样品，将样品于-20C保存;J°C.2DNA纯度与浓度的测定用核酸蛋白检测仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nrnf1.28Onm处的吸光值，计".核酸的纯度和浓度，按照公式（CD计算DNA纯度，按照公式（C.2）计算DNA质琏浓度：C=50×OD260C2)式中：cone.DN纯度CDNA成域浓度,单位为战克绿意升（M0m1.）;OD260K酸在260nm的吸光值：OO,No蛋白质在280nm的吸光值.PCR级DNA溶液的ODz60与OD280的比值应为1.77.9。(M范性)苏铁叶枯实时要光PcK栩N方法M引检和探针序列引物DGFJDGR和TaqMan-MGBHIXiP的序列见衣D.I.M1.如恒光PeR引物序列和舞针引物和探针序列(5-g)DGF5,-TGCATrGCGCTcGCTGTA-3I)GR5'-GGGCGACCfiACAATGGATDGP5'-FM-TGAGAAaCACnTCTGACAAA-MGBTD.2实时灵光P(R反应体系反应体系：0.2m1.离心管中加入2XTagMdnuniversa1.PCRMas1.CTMix1.01.,DGF(0.6mo1.1.),DGR(0.6mo1.1.)各1.2U1.探针DGP(0.6moH1.)1.21.,疑似菌株或钛似病害组织样本的DNA模板1U1.,补水至20I.,以苏铁叶枯病菌的DM或含有目标片段的合成质粒作阳性对照、不含苏帙叶枯病苗的Dw作阴性对照、以无带施储水作空白时照。将反应体系混合均匀后咒下荧光PCR仪中诳行反应.反应程序：9110min.94r5s,60,C60s,40个循环。注.PCR反应体耒中各i剂的M根据具体情况送行适当训整,0.3ttJV½在阴性对照和空白对照无C1.值且无扩增曲戏,阳性对照C1.值W30并出现典型扩埴曲线的条件卜：待测样品。值NK)时,判定为苏铁叶枯病菌阴性：仲刈样篇C1.ftW35,且出现典型的犷剧曲税,判定为苏铁叶枯病菌阳性-待测样品。值在35FO之间时,重新测试：增加DNA用业2倍10倍再次测试,待测样品出现典里扩增曲戌，且CtfftW35,判定为芥铁叶祜稳苗阳性；否则判定为阴性，苏铁叶枯白tub2片段PeRIntt方法E.1引物序引里物序列见表E。*E.1IMtPCR扩引物目标基因引物名称序列(5'-3')扩增片段tub2tub2fd5'-CTBCAa1.YCARA(XGGYCARTG-3'343bp左右tub4rd5'-CCRGYTGRCCRMRCR)bG11GTC-3E.2PCR反应体系及金»E.2.1PCRMjfi体以25U1.为例：0.2疝离心管中加入2XTaqPCRMasterMix12.5U1.正向引物1.ub2fd(10UmO1.儿)和反向引物1.ub4rd(10Uo1.D1.M1.,DX.A模板IU1.dd1.M)9.51.E.2.2PCR反应程序PCR反应程序见表E.2.*E2PCR反应程序步界RAC时一Wfftt预变性955minI变性9530835地火52308城仲72IninIf伸72IOninIE.2.3MMttI阳性对照；以苏铁叶枯衲苗的DNA样品或含有目标片段的合成侦粒为阳性对照，阴性对照：以健般寄主植物IKR为阴性对照，空白对照：以无两双蒸水代苗DM模板.e.2.4m利用表E.I中的引物对，对上述PCR产物诳行序列测定.E.2.5DNAJ利用MEGA软件或其他序列分析软件，对测序狭褥的双向峥图文件（后级名.ABD进行拼接。为确保序列可靠性,首先对测序质量进行评估（如是否有杂螃、是否双峰、长度是否与目的条带吻合等),然后去除双向测序结果两端峰形杂乱的低质量序列，再将利用反向引物1.ub4n1.测得的序列进行反向互补，最后拼接得到可就的结果序列.E.2.6B1.ASTia果分析将待测样M序列与已知序列进行相似度比对若B1.AST结果显示待测样M序列与已知的苏铁叶枯(1.)idymeUaf>k>>neru或其同物异名Perone1.1.aeag1.o>>ertM.P1.umtagk>merata的序列相似性达99%以上，与其他物种相似性小于99%,可判定为苏铁叶枯病雨.考文献郭立新，段丽君，王英超，段维军.基于TaqgMmMGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光KR检测方法4.植物病理学报,2020.50(1):97-106.2段维军，顾建锋,张恕丽,陈先锋&吴品珊.进境意大利苹果苗上却萄茎枯病曲的截获鉴定U1.植物病理学报,2014t44(5):542-545.|3)Faraz.A.,1.atif.M.Z.&YaNeen.O.(2O2O).Funj;a1.diseasesofKangiPa1.m(CyeaSrc-vo1.u1.a).InU1.HaqI.&1.jazS.(Edsa)wE1.io1.ogyandintegratedmanagementofeconomica1.1.yimportantfunga1.diseasesofornamenta1.pa1.11s(pp.265-274).Springer.4Hou.1.w.Groenewa1.dJ.Z.Pfenning.1.H.Yarden0.Crous.P.W,CaiX.(2O2O).Thcphnma-1.ikcdi1.emma.StudiesinMyco1.ogy.96:309-396.(5Huang,S.1.,WangX.Wang,T.Jiao.ZJ.Pang,F.H.TaoA.1.Niu,X.R.&1.u.W.H.(2018).FirstreportofDidyme1.1.aIeafb1.ightonCornwsOfticina1.iscausedbyDidyme1.1.ag1.om-eratainChinaTIantDisease.102(5):1031.61.aureano-Ahue1.icn.B,.MorenoVe1.azquez.M.Hernandez-Ramos.1.IvaradoRos-a1.csJ).,Saavcdra-Romcro,1.,.15.1.,Quczada-Sa1.inas,A.,&Martmcz-1.)omingucz,E.(2021).Etio1.ogyofb1.ackscabonprick1.ypeartOpuntiaficus-indica)inMexico.RevistaIneXiCdnadefitopato1.ogi339(2)329-338.7Mora1.J.ichiemberg,P.S.F.Tapage1.is.5hcrmanJ.AMichaiIidesTJ.(2018).Didyme1.1.ag1.omcratacausing1.eafb1.ightonpistachio.EuropeanJourna1.ofP1.antPatho1.ogy.151:1095-1099.|8|Nayab.M.,&Akhtar,N.(2OI6).NcvreportofCycasrevo1.uta1.eafnecrosisbyPhomahc-arum1.'r>mPakistanJournaIofP1.antDiseasesandPro1.ec1.i>n.123:193-196.9)Pan,H.,Chcn,M.Y.J)cng,1.,Wang,Z.P.JJ.,Zhong,C.H.(201.8).Firstrc-Por1.ofDidymeuag1.omeratacausingb1.acks/MdiseaseofkiwifndmChiiM.P1.antDisease.102(12):2654.|10|Va1.enzueIa-1.opez.N.Cano-1.ira.J.F.»GuarroJ.Sutton.D.A.»Wiederho1.d.N.»Cn)us,P.w.&Stchige).A.M.(2018).Coc1.omycetousDo1.hideomycctcswithemphasisonthefami1.iesCucurbitariaceaeandDidynie1.1.aceae.SiudiesinMyco1.og.90(1):I-69.(11Zhao,P.Crous.P.W.Hou.1.W.Duan.WJ.Cai.1.Ma.Y.&1.iu.F.(2021).FungiofquarantineCOnCCnIforChinaIrE)thideomycetcs.Persc>nia-Mo1.ecu)arPhy1.ogenyandEvo1.utionofFungi,47(I):45-105.GB、1443422024ZOIOI989(OIO)1.SW*U9avit9*中马X#*甲等由单峰军OOKmZ99Z-1.9909SI传*由X-Ir8>zow-8wo#±9Zi*gI叁由9II0i×088#W9三H*W¼9HZS89(O1.O)»««*»CZOeng(OIo)gs89(oo),日(Da)>"1.B-aMy(SMC009iavMv三af1.4u(6oooi)Mf1.vtaaii4urv马看闲天,闲”今中tic-ZttTtJJHf)黑掌木OVHfW44会驾X#若Y再中