GB_T43162-2023正式版欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法.docx

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1、ICS 65.020.20CCS B 16OB中华人民共和国国家标准GB/T431622023欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法DetectionandidentificationofRhagoletiscerasi(Linnaeus)2024-04-01 实施20230907发布国家市场监督管理总局关本国家标准化管理委员会发布目次前言I1范朋12规范性引用文件13术语和定义14欧洲楔桃绕实蝇基本信息15方法原理16器材和试剂27现场检疫28实验室鉴定29结果判定410样品保存411结果记录和资料保存4附录A（资料性）欧洲樱桃绕实蝇其他信息5附录B（资料性）欧洲楼桃绕实蝇为害状7附录C（资料性）欧洲樱

2、桃统实蝇形态特征图8附录D（资料性）欧洲樱桃绕实蝇与近似种分类检索裘14附录E（资料性）欧洲樱桃绕实蝇基因组DNA提取方法16附录F（资料性）欧洲樱桃统实蝇常规PCR检浏17附录G（资料性）欧洲樱桃绕实蝇实时荧光PCR检测18参考文献19本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分,标准化文件的结构和起草规则的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC27D提出并归口.本文件起草单位,中华人民共和国满洲里海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国阿拉山口海关、中华人民共和国西安海关、中华人

3、民共和国哈尔滨海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国二连海关、中华人民共和国呼和浩特海关.本文件主要起草人:刘玮琦、陈超、姜帆、赵文军、李兰、梁靓、耿俊东、郑敏、刘忠梅、梁帆、张永宏、张红梅、彭菲、马玲、刘振伟、王燕、杨雨琪、刘文敏、陈伯森、陈树华、王旭。欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法1范困本文件描述了欧洲樱桃绕实蝇RAagedsc”si(Lirmaes,1758)的检疫鉴定方法.本文件适用于植物及植物产品中欧洲楔桃绕实蝇的检疫和鉴定.2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其

4、通新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.SN/T1383-2004苹果实蝇检疫鉴定方法SN/T1847-2006寡毛实蝇类害虫分类学术语3术语和定义SN/T13832004和SN/T18472006界定的术语和定义适用于本文件.4欧洲楼机货实蝇基本信息学名：RhagOIoiscerasi(Linnaeusl1758)异名：M“seacerasi(Linnaeus*1758)KAagoZeHsfasciata(Rohdendorft1961),R60goeisnig-ripes(Rohdendorff1961)RAagoZetuobsoleta(Hering.1936).ceraci(Pers

5、son.1958)Trypetasignata(Meigen1826),Urophoracerasorum(Dufour*1845)UrophoraHturaUi(Robineau-Desvoidy1830)英文名：Europeancherryfruitfly,cherryfruitfly,cherrymaggot其他中文名称:欧洲樱桃实蝇,樱桃统实蝇分类地位:双翅目(DiPtera),实蝇科(Tephritidae),线实蝇属(RhagoIetiS)传播途径I成虫具有一定的飞行能力，可进行近距离传播,成虫、幼虫、卵随寄主果实和运输工具等进行远距离传播,老熟幼虫、蛹可随土埃、介质等进行远距离传

6、播.欧洲樱桃绕实蝇的其他信息见附录A.5方法原理根据欧洲樱桃绕实蝇的为害状，在检疫现场发现疑似欧洲樱桃货实蝇为名的果实，获取卵、幼虫、蛹或成虫等样本，卵、幼虫或蛹褥饲养至成虫后制作成针插标本，置于体视显微镜下观察,依据成虫的形态特征对种类进行鉴定;成虫样本条件不具备，具幼虫、卵、蛹或部分组织等样本时，可利用欧洲樱桃绕实蝇特异性扩增引物的常规PCR检浏方法和实时荧光PCR检测方法,进行种类鉴定.6器材和试剂6.1 银材体视显微镜、荧光定量PCR仪、PCR仪、凝胶成像分析仪、核酸蛋白检测仪、微fit组织捣碎仪、生物培养箱、超低温冰箱、冰箱等仪器设备.白登盆、防虫网累、养虫杯、养虫SL滤纸、培养皿、

7、吸水纸、牙签、离心管、广口瓶等用具.6.2 主要试剂双蒸水（ddHzO）、蒸慵水、醋酸怦、苯酚、三氨甲烷、75%乙解、100%乙醇、白砂搪、啤酒酵母、提取液Al%十二烷基硫酸蚀（SDS）,50mmol/LTrisHCKpH8.O）,25mmol/L氯化钠，25mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（PH8.0）、昆虫其因组DNA提取试剂盒、DNA快速纯化/回收试剂盒、RNA消化醐、IoXpCR缓冲液、DNAMarker、琼脂椅、上下游引物、探针、辄化镁、dNTP（脱辄核糖核昔三磷酸八TaqDNA聚合醉、2XTaqManreal-timePCRmastermix等.7现场检疫仔细检查果实表面有无产

8、卵痕迹,或果实是否有腐软的现象，剖果检杳是否有蛆状幼虫.对染虫果或者怀疑带虫的果实进行惯养观察,饲养方式见附录A中A.5.欧洲樱桃绕实堀为害状见附录B.8实验室盘定8.1 形态学鉴定8.1.1 绕实蝇属UlAagok山）形恣特征绕实蝇属（RAagoZaiS）主要形态特征如下. 成虫颊高通常不及更眼高的1/4,具下颔眠零3对4对,上额眶案2对,单眼狼发达,其长短和粗细与上额眶累相当. 触角第3节末端常呈角状突起（部分种类端圆）. 中胸背板常具4条棉毛纵带并与黑色到暗褐色的背板相映,背中零的位置较前,均在前翔上祟连线上或其稍后处.中胸背板具缝前背的梁,小盾条2对. 翅cup室宽,其宽明显超过bm室

9、的一半，且通常与bm室宽近等.径中（R-M）横脉位于接近dm翅室的中点处。CUP室后端角延长段短，其长不超过A+CuA,豚长的1/5.CuA2脉段直.M-i脉在到达期St前不上拱，与翅绿相交成角.翅基区无网状斑纹. 腹部第2节第4节腹背板（雄成虫）或第2节第5节腹背板（雌成虫）大多具淡黄色到白色的基横带.8.1.2 欧洲樱桃绕实典形态特征8.1.3 J成虫成虫（见附录C）的主要鉴定特征如下I成虫以黑色或黑褐色为主（见图C.1）,雌虫体长5.0mm-6.2Inm,雄虫体长4.0mm4.5mm 上御额梁2对,下侧额祟3对,单眼累发达，与下侧领露近等长（见图C.2）触角显短于颜,末端呈角状突起； 中

10、脚背板黑色,具4条分离的灰色纵蚊（见图C,3）, 前翅上梁存在,背中梁位于前翅上编连线上或其稍后处】 后小盾片黑褐色，中背片全黑福色； 小盾片较平坦，黄色，基部两侧具黑色斑,小盾累2对（见图C.3）; 各足腿节具暗褐色,翅具黄褐色带纹；中横带伸达翅的后缀，不与端而横带相连；端前横带和前端横带相连,具网前缘横带（见图C.4）, 三M脉端段直,寻室（CUP室）与基中室（bm室）宽近等,cup室后端角延伸段短,其长显短于哥脉与时脉的合并脉（A+CuA1）段长QuAz脉突然前倾； 簟虫腹部背板黑褐色,不具浅黄色基横带（见图C.5）.雄虫腹部背板具浅黄色基横带，第5腹节腹板后缘深凹（见图C6）; 产卵器

11、基节长是第5腹节背板长的0.75倍;产卵管末端针状,不具齿，长0.7mm0.8mm；具3个骨化的受精囊.8.1.2.2 卵卵（见附录C）的主要鉴定特征如下：卵粒大约长0.75mm宽0.25mm；长椭圆形，乳白色（见图C.7）.8.1.2.3 幼虫幼虫（见附录C）的主要鉴定特征如下： 3龄幼虫体长4.5mm6.0mm,宽1.5HIm2.0mm,蛆形，白色至黄色（见图C.8）； 口感器圆形,有2个小感器, 口钩黑色,高度骨化,1龄3龄幼虫口钩端部均具端前齿（见图C.9）； 第8腹节中间叶甚发达； 胸部前气门响形（见图C.10）,前缀指突12个15个,单排（见图C.11）；后气门位于中线上方（见图C

12、.12）,气门裂长是宽的4倍5倍,有骨化缘（见图C.13）, 肛叶大，突起,前有一不连续的小刺列，在肛开口下方有小刺群（见图C.14）.8.124靖蛹（见附录C）的主要鉴定特征如下： 围蛹，淡黄色，圆柱形：见图C.15a）长3.0mm4.0mm,宽1.5Inm2.0mm见图C.15b） 制体上残留有由幼虫前气门突起而成的暗点,后端后气门处稍收缩.8.1.3与近似种的鉴别绕实蝇属巳知共约68种，本文件描述了其中最具经济意义的种类17种.欧洲楔桃绕实蝇与近似种的分类检索表见附录D.8.2分子生物学鉴定8.2.1 实蝇基因组DNA提取欧洲楔桃统实蝇基因组DNA提取制备方法见附录E.8.2.2 常规P

13、CR检测常规PCR检测具体步骤见附录F.8.2.3 实时荧光PCR检浏实时荧光PCR检测具体步骤见附录G,阳性对照、阴性对照和空白对照的设置同FA.9结果判定9.1 形态学方法以成虫的形态特征为依据,符合8.1.2.1形态特征的个体可鉴定为欧洲樱桃绕实蝇,卵、幼虫、靖的形态特征可作为鉴定的参考依据.9.2 分子生物学方法9.2.1 常规PCR检测如果阳性对照和待测样品的电泳成像结果均出现约222bp的预期扩增片段，而阴性对照和空白对照均未出现预期扩增片段,则可判定样品为欧洲樱桃绕实蝇.9.2.2 实时荧光PCR检测在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，即阳性对照Ct值V35并出现典

14、型扩增曲线，阴性、空白对照无Ct值且无扩增曲线，则：检测样品的Ct值35时,判定为欧洲樱桃绕实蝇，检测样品无扩增曲线或Ct值40时,判定为非欧洲樱桃绕实蝇；检测样品的353OYR下游引物:5-GTAAACAGTTCAACcTGTc3OYP探针j5-FAM-AGGAGCAcCAGATATAGCTTTTcCTCaBHQ1-3G.2实时荧光PCR反应体系欧洲樱桃统实蝇实时荧光PCR反应体系见表G.2.使用具有ROX校正通道的实时英光PCR仪时,需按仪器要求添加RoX荧光试剂.反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当蠲整.囊G.2实时荧光PCR反应体系组成加样垃/L2XTagMan

15、reabtimePCRmastermix12.510molL引物OYF0.510molL引物OYR0.510molL探针OYP0.510nggL-100ngL模板DNA12ddHlO补至25G.3实时荧光PCR反应条件预变性95r30s；变性95C5s,65C退火35s,40个循环.G.4产物检资每个循环结束后收集荧光信号,根据收集的Ct值和扩增曲线判定结果.参考文献1刘玮琦，泰誉病，陈超，等.利用诱捕技术对欧洲樱桃实蝇进行监测和防控的研究进展J.植物检疫，2020,3,14-19.2刘玮琦，陈超，袁淑珍，等.欧洲樱桃实蝇风险评估及管理对策U.植物检疫，2019,h69-72.3秦誉嘉，卢国彩

16、，刘玮埼，等.樱桃绕实蝇对我国甜樱桃产业的潜在级济损失评估Ul植物检疫，2019,6:59-62.4秦誉弗，蓝帅，卢国彩，等.气候变化条件下樱桃绕实蝇在中国的潜在地理分布预测Ul植物保护学报，2019,1:63-70.5吴佳教.梁帆，梁广勤，等.实蝇类重要害虫鉴定图册M.广州，广东科技出版社，2009.6 BatemanMA.TheecologyoffruitfliesJ.AnnuRevEntomoL197217,493-518.7 BoilerEF,ProkopyRJ.BionomicsandmanagementofRhagoletisCJ.AnnualReviewofEntomologyf

17、1976921:223-246.8 BoilerEF,KatsoyannosB*HippeC.HostracesofRhagoletiscerasiL.(Dipt,tTephritid-ae)：EffectofprioradultexperienceonOvipositionsitepreferenceJ.JournalofAppliedEntomology11998122(1-5)1231-237.9 DanielC,GrunderJ.IntegratedManagementofEuropeanCherryFruitFlyRhagoletiscerai(L.)：SituationinSwit

18、zerlandandEuropeJ.Insects,2012,3(4)t956-988.10 DanielC.EntomopathogenicfungiasanewstrategytocontroltheEuropeancherryfruitHyRhagoletiscerasiLoew(Diptera：Tephritidae)D.MUnchenGermany：TechnischeUniversiUtMQnchen2009.11 FimianiP.MultilarvalinfestationsbyRhagoletiscerasi(L.)(DipteraiTephritidae)incherryf

19、ruitCavalloroR.FruitFliesofEconomicImportanceJ.Rotterdam：Balkemaf1983,52-59.12 tlkerKepenekcitSelcukHazir,AyseZDEM.Evaluationofnativeentomopathogen-icnematodesforthecontroloftheEuropeancherryfruitflyRhagoletiscerasi(L.)(DipteraiTephrit-idae)larvaeinsoilJ.如rkishJournalofAgricultureandForestry.2015,39

20、74-79.13 MoraitiCANakasCT,PapadopoulosNT.ProlongedpupaldormancyisassociatedwithsignificantfitnesscostforadultsofRhagoletiscerasi(DiPteralTephritidae)J.JournalofInsectPhysiology,2012,58.1128-1135.14 RhagoletisCeraSiEBOL.2018-05-06.http/www.cabi.org/isc/datasheet/47O5O.15 USDA-APHIS-PPQEBOL.2018-05-08

21、.EurpeanCherryFruitFlyCooperativeControlProgram,httpswww.aphis,usda.govplant-healtheadownloads2018european-cherry-fruit-fly-niagara-newyork-ea.pdf16 StomenkovicS.Peri6P,MilosevicD.RhagoletiscerasiLoew(DipteratIephritidae)-BiologicalCharacteristics.HarmfulnessandControlJ.Pesticidiifitomedidna,201227(1),269-281.