GB_T43162-2023正式版欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法.docx

ICS 65.020.20CCS B 16OB中华人民共和国国家标准GB/T431622023欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法DetectionandidentificationofRhagoletiscerasi(Linnaeus)2024-04-01 实施20230907发布国家市场监督管理总局关本国家标准化管理委员会发布目次前言I1范朋12规范性引用文件13术语和定义14欧洲楔桃绕实蝇基本信息15方法原理16器材和试剂27现场检疫28实验室鉴定29结果判定410样品保存411结果记录和资料保存4附录A（资料性）欧洲樱桃绕实蝇其他信息5附录B（资料性）欧洲楼桃绕实蝇为害状7附录C（资料性）欧洲樱桃统实蝇形态特征图8附录D（资料性）欧洲樱桃绕实蝇与近似种分类检索裘14附录E（资料性）欧洲樱桃绕实蝇基因组DNA提取方法16附录F（资料性）欧洲樱桃统实蝇常规PCR检浏17附录G（资料性）欧洲樱桃绕实蝇实时荧光PCR检测18参考文献19本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分,标准化文件的结构和起草规则的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC27D提出并归口.本文件起草单位,中华人民共和国满洲里海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国阿拉山口海关、中华人民共和国西安海关、中华人民共和国哈尔滨海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国二连海关、中华人民共和国呼和浩特海关.本文件主要起草人:刘玮琦、陈超、姜帆、赵文军、李兰、梁靓、耿俊东、郑敏、刘忠梅、梁帆、张永宏、张红梅、彭菲、马玲、刘振伟、王燕、杨雨琪、刘文敏、陈伯森、陈树华、王旭。欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法1范困本文件描述了欧洲樱桃绕实蝇RAagedsc”si(Lirmaes,1758)的检疫鉴定方法.本文件适用于植物及植物产品中欧洲楔桃绕实蝇的检疫和鉴定.2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其通新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.SN/T1383-2004苹果实蝇检疫鉴定方法SN/T1847-2006寡毛实蝇类害虫分类学术语3术语和定义SN/T13832004和SN/T18472006界定的术语和定义适用于本文件.4欧洲楼机货实蝇基本信息学名：RhagOIoiscerasi(Linnaeusl1758)异名：M“seacerasi(Linnaeus*1758)«KAagoZeHsfasciata(Rohdendorft1961),R60goeisnig-ripes(Rohdendorff1961)«RAagoZetuobsoleta(Hering.1936).ceraci(Persson.1958)»Trypetasignata(Meigen1826),Urophoracerasorum(Dufour*1845)»UrophoraHturaUi(Robineau-Desvoidy»1830)英文名：Europeancherryfruitfly,cherryfruitfly,cherrymaggot其他中文名称:欧洲樱桃实蝇,樱桃统实蝇分类地位:双翅目(DiPtera),实蝇科(Tephritidae),线实蝇属(RhagoIetiS)传播途径I成虫具有一定的飞行能力，可进行近距离传播,成虫、幼虫、卵随寄主果实和运输工具等进行远距离传播,老熟幼虫、蛹可随土埃、介质等进行远距离传播.欧洲樱桃绕实蝇的其他信息见附录A.5方法原理根据欧洲樱桃绕实蝇的为害状，在检疫现场发现疑似欧洲樱桃货实蝇为名的果实，获取卵、幼虫、蛹或成虫等样本，卵、幼虫或蛹褥饲养至成虫后制作成针插标本，置于体视显微镜下观察,依据成虫的形态特征对种类进行鉴定;成虫样本条件不具备，具幼虫、卵、蛹或部分组织等样本时，可利用欧洲樱桃绕实蝇特异性扩增引物的常规PCR检浏方法和实时荧光PCR检测方法,进行种类鉴定.6器材和试剂6.1 银材体视显微镜、荧光定量PCR仪、PCR仪、凝胶成像分析仪、核酸蛋白检测仪、微fit组织捣碎仪、生物培养箱、超低温冰箱、冰箱等仪器设备.白登盆、防虫网累、养虫杯、养虫SL滤纸、培养皿、吸水纸、牙签、离心管、广口瓶等用具.6.2 主要试剂双蒸水（ddHzO）、蒸慵水、醋酸怦、苯酚、三氨甲烷、75%乙解、100%乙醇、白砂搪、啤酒酵母、提取液Al%十二烷基硫酸蚀（SDS）,50mmol/LTrisHCKpH8.O）,25mmol/L氯化钠，25mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（PH8.0）、昆虫其因组DNA提取试剂盒、DNA快速纯化/回收试剂盒、RNA消化醐、IoXpCR缓冲液、DNAMarker、琼脂椅、上下游引物、探针、辄化镁、dNTP（脱辄核糖核昔三磷酸八TaqDNA聚合醉、2XTaqManreal-timePCRmastermix等.7现场检疫仔细检查果实表面有无产卵痕迹,或果实是否有腐软的现象，剖果检杳是否有蛆状幼虫.对染虫果或者怀疑带虫的果实进行惯养观察,饲养方式见附录A中A.5.欧洲樱桃绕实堀为害状见附录B.8实验室盘定8.1 形态学鉴定8.1.1 绕实蝇属UlAagok山）形恣特征绕实蝇属（RAagoZaiS）主要形态特征如下. 成虫颊高通常不及更眼高的1/4,具下颔眠零3对4对,上额眶案2对,单眼狼发达,其长短和粗细与上额眶累相当. 触角第3节末端常呈角状突起（部分种类端圆）. 中胸背板常具4条棉毛纵带并与黑色到暗褐色的背板相映,背中零的位置较前,均在前翔上祟连线上或其稍后处.中胸背板具缝前背的梁,小盾条2对. 翅cup室宽,其宽明显超过bm室的一半，且通常与bm室宽近等.径中（R-M）横脉位于接近dm翅室的中点处。CUP室后端角延长段短，其长不超过A+CuA,豚长的1/5.CuA2脉段直.M-i脉在到达期St前不上拱，与翅绿相交成角.翅基区无网状斑纹. 腹部第2节第4节腹背板（雄成虫）或第2节第5节腹背板（雌成虫）大多具淡黄色到白色的基横带.8.1.2 欧洲樱桃绕实典形态特征8.1.3 J成虫成虫（见附录C）的主要鉴定特征如下I成虫以黑色或黑褐色为主（见图C.1）,雌虫体长5.0mm-6.2Inm,雄虫体长4.0mm4.5mm 上御额梁2对,下侧额祟3对,单眼累发达，与下侧领露近等长（见图C.2）»触角显短于颜,末端呈角状突起； 中脚背板黑色,具4条分离的灰色纵蚊（见图C,3）, 前翅上梁存在,背中梁位于前翅上编连线上或其稍后处】 后小盾片黑褐色，中背片全黑福色； 小盾片较平坦，黄色，基部两侧具黑色斑,小盾累2对（见图C.3）; 各足腿节具暗褐色,翅具黄褐色带纹；中横带伸达翅的后缀，不与端而横带相连；端前横带和前端横带相连,具网前缘横带（见图C.4）, 三M脉端段直,寻室（CUP室）与基中室（bm室）宽近等,cup室后端角延伸段短,其长显短于哥脉与时脉的合并脉（A+CuA1）段长QuAz脉突然前倾； 簟虫腹部背板黑褐色,不具浅黄色基横带（见图C.5）.雄虫腹部背板具浅黄色基横带，第5腹节腹板后缘深凹（见图C6）; 产卵器基节长是第5腹节背板长的0.75倍;产卵管末端针状,不具齿，长0.7mm0.8mm；具3个骨化的受精囊.8.1.2.2 卵卵（见附录C）的主要鉴定特征如下：卵粒大约长0.75mm宽0.25mm；长椭圆形，乳白色（见图C.7）.8.1.2.3 幼虫幼虫（见附录C）的主要鉴定特征如下： 3龄幼虫体长4.5mm6.0mm,宽1.5HIm2.0mm,蛆形，白色至黄色（见图C.8）； 口感器圆形,有2个小感器, 口钩黑色,高度骨化,1龄3龄幼虫口钩端部均具端前齿（见图C.9）； 第8腹节中间叶甚发达； 胸部前气门响形（见图C.10）,前缀指突12个15个,单排（见图C.11）；后气门位于中线上方（见图C.12）,气门裂长是宽的4倍5倍,有骨化缘（见图C.13）, 肛叶大，突起,前有一不连续的小刺列，在肛开口下方有小刺群（见图C.14）.8.124靖蛹（见附录C）的主要鉴定特征如下： 围蛹，淡黄色，圆柱形：见图C.15a）长3.0mm4.0mm,宽1.5Inm2.0mm见图C.15b） 制体上残留有由幼虫前气门突起而成的暗点,后端后气门处稍收缩.8.1.3与近似种的鉴别绕实蝇属巳知共约68种，本文件描述了其中最具经济意义的种类17种.欧洲楔桃绕实蝇与近似种的分类检索表见附录D.8.2分子生物学鉴定8.2.1 实蝇基因组DNA提取欧洲楔桃统实蝇基因组DNA提取制备方法见附录E.8.2.2 常规PCR检测常规PCR检测具体步骤见附录F.8.2.3 实时荧光PCR检浏实时荧光PCR检测具体步骤见附录G,阳性对照、阴性对照和空白对照的设置同FA.9结果判定9.1 形态学方法以成虫的形态特征为依据,符合8.1.2.1形态特征的个体可鉴定为欧洲樱桃绕实蝇,卵、幼虫、靖的形态特征可作为鉴定的参考依据.9.2 分子生物学方法9.2.1 常规PCR检测如果阳性对照和待测样品的电泳成像结果均出现约222bp的预期扩增片段，而阴性对照和空白对照均未出现预期扩增片段,则可判定样品为欧洲樱桃绕实蝇.9.2.2 实时荧光PCR检测在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，即阳性对照Ct值V35并出现典型扩增曲线，阴性、空白对照无Ct值且无扩增曲线，则：检测样品的Ct值35时,判定为欧洲樱桃绕实蝇，检测样品无扩增曲线或Ct值>40时,判定为非欧洲樱桃绕实蝇；检测样品的35<Ct值40时,应重新进行测试.10样品保存用于形态学鉴定所采集的标本若有多头，则一部分保存在内盛75%乙薛的广口瓶中，另一部分制成针插标本，同时注明货物来源、寄主、采集时间、地点及采集者,长期保存，用于分子生物学鉴定的标本用100%乙醇浸泡,保存于-70C超低温冰箱中备用.11结果记录和资料保存完整的试验记录包括:样品的来源、种类、接收时间，试舱的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和试验人员的签字.PCR检浏需有电泳结果照片，实时荧光PCR检测籥有检浏结果照片。相关资料保存6个月以上.附录A（资料性）欧洲楔械绕实蝇其他信息A.1地理分布亚洲：伊朗、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦、土库曼斯坦.欧洲：奥地利、比利时、保加利亚、克罗地亚、捷克、斯希伐克、爱沙尼亚、法国、德国、希腾、匈牙利、意大利、拉脱维亚、立陶宛、摩尔多瓦、荷兰、揶威、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、俄罗斯、塞尔维亚、黑山、西班牙、瑞典、瑞士、格鲁吉亚、土耳其、乌克兰.北美洲:加拿大、美国.A.2寄主植物茜薇科ROSaCeae：酸樱桃Prunusc”sus,欧洲甜樱桃Prunustivm,黑樱桃PrunusEa马哈利酸樱桃Prunusmahaleb.忍冬科CaPrifOliaeeae:金银忍冬LoniceraHWo"ewn、新疆忍冬LoniceraS必Tea、小花忍冬Loni-ceratataricaL.var.Micrantha.A.3生物学习性1年1代，以专性滞育嫡在紧邻寄主的土城中越冬.越冬蛹进入滞育需要一个寒冷时期.仅5%15%的蜻可以在笠年春天羽化为成虫,其余的蛹可继续在土壤中滞育1年2年,少数蟠可在土壤中滞育多年.靖在高黏性土墟滞育率高于砂性土壤.这些遗留在土填中的嫡表现高度的适生性，以避免其种群在寄主植物不结果的年份遭到灭绝.在羽化为成虫的前几天，蜻从黄色变成绿色.成虫的出现和生命周期与寄主植物的物候习性关系密切.成虫的羽化受到春季土场温度、冬季滞育的温度条件和寄主植物地理位置的影响.在欧洲和亚洲，羽化的成虫通常发生在5月中旬至6月中旬.产卵前,成虫需通过6d13d的时间发育成熟,其主要食物为鸟类和植物蜜露等.欧洲樱桃绕实蝇整个成虫期可长达7周11周.产卵发生在温度升高到16T以上的温暧天气.持续的晴好天气能够引起产卵极度爆发.成虫通常在樱桃由绿变黄，樱桃核逐渐变硬，果肉至少5mm厚时产卵.雌虫通过产卵器刺穿水果，在略低于表皮处产一颗单卵，产卵后，雌虫拖动产卵器在水果表面释放一种水溶性寄主标记信息素.这种信息素可以阻止在同一粒水果上的进一步的产卵行为。但在寄主果实匮乏时会发生同一粒果实上的双卵情况.每头雌虫最多可产卵469粒卵（平均200粒/头），每天产卵可多达59粒（平均26粒/头）卵的孵化率在54%100%之间.幼虫共3个龄期，3龄幼虫大小为4.5mm6mm.幼虫发育至老熟幼虫的时间受温度和寄主果实的成熟期影响，通常为17d30d.幼虫在离糖分和低酸度的果实中发育较好.A.4为宙情况雌成虫在被害果实上留下微小的产卵孔，卵在果实内发育成幼或，幼虫以果肉为食。幼虫破坏果肉，并产生粪便污染果实,严重影响果实品质.蛀食前期果实无明显为害状,后期因病菌的侵入会造成果实腐烂.A.5饲养方式A.5.1卵或幼虫的饲养将现场采取的卵或幼虫部分个体制成鉴定标本，其余个体继续用原寄主果实培养.具体的培养方法为:将带有卵或幼虫的寄主果实放在小号白登盘里，然后将小号白瓷盘放在装有自来水的大号白登盘内，再用防虫网罩住小号白俄盘,罩的下方边缘浸没于大号白瓷盆内的水中.置于温度为2OT25C、相对湿度为30%60%的生物培养箱中饲养至幼虫老熟.A.5.2蛹的饲养取一盛有洁净细砂的养虫杯（沙子厚度10cm,含水量5%10%）,将现场检疫收集的或室内培养得到的围嫡埋于距细砂表面3Cm5cm处（若是老熟幼虫则可直接将其置于细砂表面，幼虫将钻入沙中化烯）将养虫杯放置于5C以下的冰箱中冷藏18Od左右,取出养虫杯置于温度为22匕25匕、相对湿度为30%60%的生物培养箱中饲养，直至成虫羽化.K5.3成虫的饲养成虫羽化后,悬挂相应寄主果实切片于养虫箱内供其取食;或将白砂糖和啤酒酵母按照1*2（质证比）混合制成饲料放入小容器中喂养，此外，在培养皿中放入几张滤纸,加适垃的水浸透滤纸供成虫饮用.待成虫斑蚊的色泽和大小检定（3d5d）后，收集成虫并置于冰箱冷冻层（约一201）0.5h1h,杀死后，制作标本.欧洲樱桃绕实蝇成虫产卵为害状见图B.1,幼虫为害状见图B.2.(引自Dftnid等.2012)图BJ成虫产卵为害状附蛾B（资料性）欧洲樱桃绕实倏为害状(引自https:/www.ipmimages.org/brow5e/subthumb.cfm?sub=12166)b)（引自Dhniel2012）图B.2幼虫为害状附录C（资料性）欧洲樱桃绕实蝇形态特征图欧洲樱桃绕实蝇成虫背面观见图C.I.成虫头部和胸部侧面观见图C.2,成虫中胸背板和小盾片见图C.3.成虫翅见图C.4,雌虫腹部背板图C.5,雄虫腹部背板见图C.6.图C.1成由背面观（仿White和Elsonharris.1992）图C.2成虫头部和阖部侧面观图C3成虫中胸背板和小盾片图C.6雄虫腹部背板欧洲樱桃绕实蝇卵的形态特征见图C.7（引自DaniCl等2O12）图C.7卵欧洲樱桃绕实蝇3龄幼虫见图C.8.幼虫口钩见图C9幼虫前气门姐图C.1O,幼虫前气门指突见图C.11,幼虫后气门见图C12,幼虫后气门气门裂图C.13,幼虫肛叶见图C.14.图C.83龄幼虫IO图C.9幼虫口钩图Clo幼虫前气门图C.11幼虫前气门指突图C12幼虫后气门A&i用图C.13幼虫后气门气门裂图C.14幼虫肛叶场的形态特征见图C.15.a)b)图C.15蛹34567891011121314附录D（资料性）欧洲梗视缝实蚂与近似种分类检索表中胸背板和腹部黄色到橙色,盾片不具灰色纵条2中脚背板和腹部黑色,盾片有2条4条灰色纵条.小盾片两侧具黑色斑纹,有时基带宽4甥无明显的亚基横带,但有时亚基区（尤其是C室的基部）色带略暗，端前横带和前端横带通常分离三带胡桃绕实蝇R，“0叫力$翅具有显著的亚基横带，端前横带和前端横带在C脉和R,+s脉之间相连，且连接处宽，R4+5脉和M脉处无任何分离斑3中横带和端前横带相连于dm室并覆及此室整个宽度，端前横带有叉口，因此出现一透明区，此区从翔的后缘延伸到dm室，中背片橙色美翅翅实后Rm到5中横带和端前横带常分离,但有时与dm室或CuA1脉后方狭窄相连；中脚背板全为暗褐色或具有一对垂直的暗福色中纵条核桃绕实蝇Rem"es小盾片仅两侧具斑,基部黄福色或略黑5小盾片基部黑色,黑色部分至少占1/5,但基部和M面的黑斑有时分离6韧具后端横带和前端横带，中横带和端前横带沿M脉和CuAl脉相连，在dm室端1/4形成一透明斑,翅无副前缘横带黑樱桃绕实蝇Rws翅无后端横带，中横带和始前横带分离，有一副前缘横带,但个体甚小者例外欧洲樱桃绕实蝇R.CElSi翅具副前缘横带7翅无副前缘横带10中脚背板上的4条纵条前方联合伸到背板前缘.遗无后端横带,但在端前横带和前端横带之间的M脉段上有烟梅色分离斑,前端横带常缩小成分离斑横过氏+$脉的端部。小盾片有黑色基带和的黑色斑茄瓜绕实蝇R.now中胸背板至少有2条纵条明显分离8中胸背板两例纵条各自在端部相连.翅具副前缘横带，前端横带和端前横带在rl室端部相连,无后端横带番茄绕实蝇RQmaAs中脚背板4条纵条两两分离9翅具后端横带,此带不与其他任何横带相连.中胸背板上的«9纵条仅前端伸到横缝,或略伸到横缝之前端纹番茄绕实蝇R.IycoperseUa翔无后端横带。中脚背板上的侧纵条前端伸过横缝茄绕实蝇R.amersa翅端前横带与前缘脉分离，出现透明区；该区横过Rza脉和氏+s部11翔前端横带与前缘脉间无透明区;该横带至少横过R+s脉的端部，或有分离斑覆盖及凡+s脉的部16端前横带从徐近RM横脉处倾斜走向，与前端横带近平行12端前横带横过翔面15产卵管通常长；以苹果类为寄主的个体其产卵管长1.0mmL4mm；以山楂类为寄主的个体其产卵管长1.0mmL4mm,但佛罗里达的种群，其个体的产卵管长度却只有0.7mm1.0mm.幼虫为害蔷薇科如革果属和山植属等植物果实苹绕实蝇R"omondla产卵管通常较短,长为0.7mm-l.lmm.幼虫为害的寄主植物不同上述13幼虫为害杜鹃科EriCaCeae植物,特别是越橘属Vaccinium植物（包括伞房花越橘V.cormbo-sum«窄叶鸟饭树V.angustifolium越橘V.vi,iside）和Gaylussacia属植物（黑果Gaylus-saciabaccala,悬果G,frondosa,短黑果G.dumosa）2.3mm3.4mm越橘绕实热R.mendax幼虫为害的寄主植物不同上述1414幼虫为害忍冬科CaPrifOIiaCeae的毛核木属SymMOTCarPoS植物R.zephyria幼虫为害山茶萸科Cornaceac的株木展Comus植物的一些种类（包括红串果C.CanadensiS偎伏株木CMmOm“m,熊果株木C.monier）R.comiora15基横带和中横带在A+CuAz脉上方连结山茱萸实蝇种团R.S庆rigroups基横带和中横带不相连酷栗绕实蝇R.ribicola16翅具后端横带酸浆绕实蝇R."ri"11翅无后端横带;前端横带有时在其端部被分割出一个分离斑，该斑差及Ra脉的端部东部樱桃绕实蝇种团R.Cingulatagroups附录E(资料性)欧洲樱桃缝实蝇基因用DNA提取方法E.1实蝇基因组DNA提取取实蝇样本(成虫、卵、幼虫、虫蛹或部分组域等)于双蒸水中漂洗数次，吸水纸吸干，体视显微镜下剔除其表面的附着物，虫蜻去掉蛹壳.置于1.5mL离心管中，加入40L提取液A,放置于一70P冰箱中,2Omin后取出，用灭菌牙签或微圻组织捣碎仪捣碎，匀浆，加入等体积3mnolL醋酸钾(pH7.2),冰上放置1h,加入等体积笨酚和三氨甲烷,混匀，12000g离心10min,取上清液,加入2倍体积冰冻100%乙静混匀，放置冰箱Ih沉淀DNA,12OOOg离心15min弃上清液，加入ImL75%乙醉洗涤沉淀，12000g离心1min,晒干乙醇后用100L双蒸水溶解沉淀,用核酸造白检浏仪测定DNA浓度和纯度后,将提取的基因组DNA于-20C保存备用；也可采用试剂盒方法提取基因组DNAeE.2DNA质量检直用核酸量白检浏仪测定DNA的纯度与浓度,分别取得260nm和280nm处的吸光值,计算核酸的纯度和浓度，按照公式(E.1)计算DNA纯度，按照公式(E.2)计算DNA浓度：(E.2 )_oc0ncs0p=50XOD2t0式中】cone.DNA钝度；PDNA质量浓度,单位为微克每毫升“g/mL)JOo核酸在26Onm的吸光值：ODjw蛋白质在28Onm的吸光值.PCR级DNA溶液的ODMe与ODJeO的比值应为1.71.9.附录F（资料性）欧洲樱桃缢实蝇常规PCR检测F.1引物序列欧洲樱桃统实蝇常规PCR扩增引物序列见表F.I.表F.1引物序列引物名称引物序列PCR产物大小bpOYF上游引物:5'CrAATTGTTACAGCcCATGeC-3'222OYR下游引物：5'-GTAAACAGTTCAACcTGTc3'F.2常规PCR反应体系常规PCR反应体系见表F.2,表中反应体系各试剂的盘根据具体情况或不冏的反应总体积进行适当调整.«F.2常JKPCR反应体系姐成加样StAxLIOXPCR缎冲液2.550mtnol/L氨化候2.010mmol/LdNTP2.010HmOI/L引物OYF1.010MmoI/L引物OYR1.05ULTaqDNA聚合瞬0.510ngpL-100ngL模板DNA1.0ddHtO朴至25F.3常规PCR反应条件预变性95C3min；变性95C15s,退火65C1min,延伸72tC30s,30个循环；72C10min（当使用不同PCR仪和试剂时,可视情况对反应叁数进行适当调整）F.4阳性对照、阴性对照和空白对照的般置阳性对照I欧洲樱桃绕实蝇的DNA或含有待测基因序列的质粒为PCR模板.阴性对腹I不含欧洲樱桃绕实蝇的实据DNA为PCR模板.空白对照：双蒸水.各做2个重纪.F.5琼服糖凝胶电泳检冽制备1.5%的琼脂糖凝胶，电泳结束后,在凝胶成像分析仪的紫外投射光下观察、拍照.附量G（资料性）欧洲慢机统实蝇实时荧光PCR检利GJ引物及探针序列欧洲樱桃统实蝇实时荧光PCR引物及探针序列见表G.I.«G.1引物及探计序列引物/探针名界引物/探针序列OYF上游引物：5'-GTAATTGTTACAGCCCATGa>3'OYR下游引物:5'-GTAAACAGTTCAACcTGTc3'OYP探针j5'-FAM-AGGAGCAcCAGATATAGCTTTTcCTCaBHQ1-3'G.2实时荧光PCR反应体系欧洲樱桃统实蝇实时荧光PCR反应体系见表G.2.使用具有ROX校正通道的实时英光PCR仪时,需按仪器要求添加RoX荧光试剂.反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当蠲整.囊G.2实时荧光PCR反应体系组成加样垃/L2XTagManreabtimePCRmastermix12.510molL引物OYF0.510molL引物OYR0.510molL探针OYP0.510nggL-100ngL模板DNA12ddHlO补至25G.3实时荧光PCR反应条件预变性95r30s；变性95C5s,65C退火35s,40个循环.G.4产物检资每个循环结束后收集荧光信号,根据收集的Ct值和扩增曲线判定结果.参考文献1刘玮琦，泰誉病，陈超，等.利用诱捕技术对欧洲樱桃实蝇进行监测和防控的研究进展J.植物检疫，2020,3,14-19.2刘玮琦，陈超，袁淑珍，等.欧洲樱桃实蝇风险评估及管理对策U.植物检疫，2019,h69-72.3秦誉嘉，卢国彩，刘玮埼，等.樱桃绕实蝇对我国甜樱桃产业的潜在级济损失评估Ul植物检疫，2019,6:59-62.4秦誉弗，蓝帅，卢国彩，等.气候变化条件下樱桃绕实蝇在中国的潜在地理分布预测Ul植物保护学报，2019,1:63-70.5吴佳教.梁帆，梁广勤，等.实蝇类重要害虫鉴定图册M.广州，广东科技出版社，2009.6 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