微生物与酶工程制药复习2.doc

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1、二、 问答4.如何从环境中筛选稀有放线菌中的小单孢菌，并说明各步骤的作用？（一）所谓的稀有放线菌：即为除链霉菌属外的其它属的放线菌。如：小单孢菌、小双孢菌、马杜拉放线菌等。选择培养分离微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：（1）抑制大多数其它微生物的生长。（2）使待分离的微生物生长更快。 使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。（3）使待分离的微生物生长“突出”。 直接挑取分离的微生物的菌落获得纯培养。1）利用选择培养法进行直接分离：、高温下培养：分离嗜热细菌。 、培养基中不含N：分离固氮菌。 、培养基加抗生素：分离抗性菌。 利用选择平板进行直接分离：、牛奶平板：分离

2、蛋白酶产生菌。 、颜色反应：分离特定的菌株。 、利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化。2）富集培养：特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加从自然界中分离到所需的特定微生物（二）高选择性分离小单孢菌的程序：土样自然风干制成土壤悬浮液15%苯酚处理涂布平板（HV琼脂+萘啶酸20mg/L+衣霉素20mg/L）衣霉素和萘啶酸作为细菌、真菌和非目的放线菌的抑制剂。6.如何利用同位素标记法研究微生物药物生物合成的机理？将同位素标记可疑前体物质加到培养基中培养后分离目的代谢产物测定终产物中同位素含量和分布情况判断可疑前体物质是否参与代谢产物的合成16.如想开发生产葡萄糖

3、苷酶的基因工程菌，该如何构建？如想进一步提高该酶的表达量，该如何进行？假如重组表达的酶以包涵体形式存在，以你学到的知识分析应该采取什么措施？基因工程酶（蛋白）的构建（1）基因的获取（通过NCBI搜索欲构建的葡萄糖苷酶的基因序列，再设计引物，以所需的cDNA为模板PCR获得）。（2）目的基因与表达载体的体外重组。（3）导入宿主细胞。（4）筛选和验证。（5）目的基因的表达。提高表达量：（1）利用高效表达质粒（强启动子和高拷贝）。 （2）优化密码子。 （3）优化翻译起始区的二级结构。 （4）使ATG和SD序列之间距离为9bp。 （5）优化表达条件。减少包涵体：（1）降低培养温度。 （2）减少诱导剂的

4、使用量。 （3）12.论述抗生素的作用机理？（1）抑制细菌细胞壁的合成。（2）增加细菌细胞膜的通透性。（3）抑制细菌蛋白质的合成。（4）抑制细菌核酸的合成。（5）干扰细菌的能量代谢。（6）增强吞噬细胞的功能。13.从你的观点谈谈细菌耐药性的控制策略？（1）合理使用抗菌药物，加强对细菌耐药性的监测。（2）严格执行消毒隔离制度，应对耐药菌感染的患者隔离；避免医院内交叉感染。（3）加强药政管理，严格执行抗菌药物凭处方供应。（4）加强新抗菌药物的研制。（5）加强质粒消除剂的研制。（6）抗菌药物的“轮休”有计划地将抗菌药物分期分批交替使用，对控制细菌耐药性有一定作用。15.请简述微生物来源的抗肿瘤药物研

5、发的一般过程。微生物药物研发的一般程序微生物药物研究的一般程序：（1）微生物药物产生菌、有效菌株的筛选、保藏及选育。（2）发酵。（3）药物的分离纯化。（4）药物的化学鉴别和结构测定。（5）药理与临床评价。（6）工业化研究。（7）基础研究。微生物药物研究开发的一般程序9.在微生物制药的种子扩大培养过程中，需要考虑到哪些方面的问题？（一）种子培养的目的与要求：（1）种子扩培的目的：1）接种量的需要。 2）菌种的驯化。 3）缩短发酵时间、保证生产水平。（2）种子的要求：1）活力强，移种至发酵后能够迅速生长，迟缓期短。 2）生理状况稳定，个体与群体。 3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。 4）

6、无杂菌污染。 5）保持稳定的生产能力。（3）种子制备过程：斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵（二）种子制备的技术概要：（1）实验室阶段：1）培养物选择的原则：目的种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为2类：对于不产孢子和芽孢的微生物：获得一定数量和质量的菌体对于产孢子的微生物：、获得一定数量和质量的孢子 、获得一定数量和质量的菌丝体2）培养基选择的原则：培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。培养基的原料一般都比较精细（实验室种子培养阶段，规模一般比较小，为了保证培养基的质量）3）起始接种物的传代问题：细菌：保藏斜面 活化斜面 产孢子：保藏

7、母斜面 子斜面原则：使菌种的传代次数尽可能的少。*孢子培养：*母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去除变异株。所以接种时要稀一点，便于纯化生长到单菌落。*子瓶：大量繁殖，得到大量孢子。 *接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落。 接种时密一点，得到大量的孢子。（2）生产车间阶段：1）培养物的选择原则：菌丝体比孢子要有利缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果2）培养基选择的原则：目的获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，2方面原因：成本；驯化（3）发酵级数的

8、确定：一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。*发酵级数确定的依据：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般24级。 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。（4）接种量的确定：接种量= 过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为715%。但是一般认为大一点好。*双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。*倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。（5）种龄：是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。1）种龄短：菌体太少；2）种龄长：易老化原则：对数生长期末，细

9、胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。（6）种子的质量要求：1）量：要求达到一定的浓度 2）质：菌丝形态、培养液外观（生长处于某个阶段、均匀等等） C、N、P的含量，pH值，酶活等 无污染（无杂菌）（7）影响种子质量的因素：1）固体种子：培养基 培养条件：温度、湿度、培养时间、冷藏时间 接种量 2）液体种子：培养基 培养条件：温度、通气量 种龄 接种量：通常细菌15%，酵母510%，霉菌715%8.非定向诱变的突变生物合成基本流程？出发菌株的选择琼脂块法选择摇瓶复筛区段合成产物，连接酶等生化特性的研究添加结构类似物A或B阻断突变株筛选有生理活力的突变株 无生理活力的突变株 无生理活

10、力的突变株 有生理活力的突变株有区段合成产物、无连接酶等 有区段产物A 有区段产物B 活性的突变株 有连接酶等活性的突变株 有连接酶等活性的突变株 发酵培养 样品收集 TLC、HPLC检测及制备 结构检测采集土样（或其他用于分离微生物的样品） 平板分离培养 斜面培养 摇瓶发酵 一次筛选是否新药理活性有无活性无其他模型筛选有无活性无放弃是否稳定否化学修饰或放弃是否新化合物是专利申请是否有效否放弃是否符合要求是否是否安全有效否放弃是是有小发酵罐发酵提取粗提物（纯度2050%）二次筛选有提纯（纯度90%）稳定性研究 长期保存 产生菌鉴定 是理化性质和化学结构研究 动物药效学研究 制剂研究否放弃 否

11、是 毒理研究 药动学和药代学研究 化学修饰或放弃 专利申请 工艺研究 临床试验 是 报批生产 上市1.抗生素的定义：抗生素是微生物在其代谢过程中所产生的、具有抑制它种微生物生长及活动甚至杀灭它种微生物性能的化学物质。 一般定义：“抗生素”是在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的、是在微生物生命过程中产生的具有生物活性的次级代谢产物及其衍生物。2.抗生素与抗菌药物的区别：（1）完全通过化学合成方法制备的磺胺类、氟喹诺酮类和恶唑烷酮类等抗细菌药物，以及像酮康唑类抗真菌药物被称之为抗菌药物，而不属于抗生素的范畴。（2）而对于像磷霉素和氯霉素这些原来是来源于微生物的次级代谢产物，但由于结构简单而

12、用化学合成的方法代替微生物发酵法来生产制备的品种，以及像源于微生物次级代谢产物硫霉素，后完全用化学合成方法制备的一系列碳青霉烯类-内酰胺抗生素等，通常将其归纳在抗生素的范畴。3.微生物产生拮抗作用的可能原因：（1）营养物质被消耗 （2）培养基的理化性质被改变 （3）微生物产生的酶的作用 （4）产生毒物或抗生素 （5）空间的争夺4.基因突变的特点：适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。（1）不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。（2）自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。（3）稀有性：突变率低且稳定。（4）独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。（5）可诱发性：诱变剂可提高突变率（10105倍）。（6）稳定性：变异性状稳定可遗传。（7）可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变。5.细菌菌膜：是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，由细菌和自身分泌的胞外基质组成。 细菌菌膜耐药机制：（1）渗透限制；（2）营养限制；（3）表达耐药表型； （4）细菌菌膜的不均一性