原核诱导表达.docx

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1、原核诱导表达的标准操作程序（SOP；.目的：使本试验室工作人坊了解i先导去达的操作过程，并能实际动手诳展原核诱旧表达-系列试脍.二.适用范围：本SOP适用于对新法因克隆的去达，并针对新舰因产生的可溶性蛋白.三.试验原理：的乳能操纵手含Z、丫及A三个构造基因，分别编码半乳糖伴肺、透油和乙凝基转移前，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调整班因1。1联因编码种阻遇蛋白，后者与0序列结合，使操板子受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点.小P序列、。序列和CAP结合位点共同构成IaC操纵子的网控区，一:个鼠的编码基因即由同一网控区调整,实现加因产物的

2、协调表达,在没有扎糖存在时，Iac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵卜表达的1.aC阳遏蛋白与O序列结合，阳咫RNA景合酹与P序列结合,抑制转录起动.当有乳糖存在时,Iac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，英正的法导剂并非乳精本身.乳越进入细胞，经b一半乳精背Ife催化，转变为半乳期.后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象改变，导致阳遇蛋白与O序列解离、发生转录.异丙基破代半孔楠昔（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而特别稳定,因此被试5金室广泛应用.四、试剂打算：（一）试验器材的灭曲：枪头的灭菌：Im1.,2001.201.的枪头放入枪头盒.用报纸包住

3、（2层）,放入高压灭菌锅中灭菌，I21C,20min,80C烘箱中烘干，常温放眼。摞口管及肉心管的灭菌：将蝶”管和高心管分别放入铝制饭盒中（盅子要拧松，离心管的管靛翻开），放人高压灭由锅中灭曲，121C,20min.80C烘箱中烘干，常温放置。50m1.高心管的灭菌：将50m1.离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌,I2IC,20min.80C供箱中烘干，常温放置.（二）1.B培育基的配制液体1.B培H票（I1.）：Ifi白珠IOg氯化钠IOg酵母提取物5g调PH（ft到.高乐灭菌.4C保存.固体1.BJSW（I1.J：蛋白珠IOg氯化钠IOg酵母提取物5g琼脂粉15g高压灭前，不烫

4、手的状况下参与抗性，抗性：培育型=1；100O（也节，卡那通常浓度），混匀。立刻在无曲操作台中倒平板，并开大风吹干。用封口腴封住,倒置放于4X2保存。（）IM1.PTG的配制:经过计算，IOgIpTG可以配42m1.的IM1.PTG,买来的粉末状的IPTG一般全部配成IMIPTG.I、无菌操作台紫外线照镶后通风.2、用少崎去离子水将IPTG溶解完全，并定容。3、在无曲操作台中，用2m的速器将配好的IPTG沌入灭曲后的离心管中，过泄除菌,-20C保存.考前须知：在用谑器珞IPTG注入离心管时，先用针头吸IPTG,然后将枪头拔掉,排出气体，沌头参与IPTG液，花使针管与沌器相连，保证整个装置无气体

5、进入.沌的过程中.手不他碰漉头.(四)3SDSMGE1.oadingbuffer的配制：3SDS-IGE1.oadingbufferIOmIIMTris-Hc1.(PH6.8)SDSBPB（洌酚收）30mg甘油（丙三丁）3m1.去商子水1 .将除BPB以外的药品完全溶解.SDS常温下很难溶解,可以在37C水溶溶解.完全溶解后，再参与BPB进展溶解，2 .把溶好的buffer分装到的离心管中，InW管，常温放汽，3 .运用前，W参与301.装将乙卷.考前须知：软基乙酹为危急品.参与的过程在通风枷中完成,弁且带好手套，（）IOXPBS的配制：PBS(IOxPBS)I1.NaH2PO4JH2ONac

6、1.85gNa2HPOi.12HO用去肉子水将以上药品进展溶解。（溶解的特别慢，可能须要过夜）周PH值到,用的灌膜过液.常讯保存.工作时用的是IxPBS.(六)Tris-Hc1.(PH8.8)的配制：Tris-Hc1.250m1.Trisg1 .用20OmI去禺子水将TriS溶解。2 .用浓盐酸冏PH值到.3 .调好PH的Tris-Hc1.定存到250m1.4 .的沙膜过谑，常温保存。考前须知：TriS的缓冲实力彼强,调PH值时,费些时间,但不要调过.3.调好PH的TriS-HC1.定容到250m1.4.的渔膜过谑，常温保存“（八）30%丙烯酰胺的配制:30%丙烯眦胺250m1.丙烯酰胺72.

7、5m1.BIS卬叉丙烷配胺2.5m1.1.把药品用去黑子水溶解后定容到250m1.2.用泌纸过逑，放在棕色粒子中，4C保存.考前须知：两种药品有以性，配制过程要带手套和口罩。5 九）10%SDS的用制：1 .IgSDS参与IOmI去离子水进展溶解2 .分装到离心管中，-2OC保存。（十）10%过硫酸僮的配制：1 .Ig过破酸皱参与Iom1.去离子水进展溶解，2 .分装到离心管中，-20C保存。（十-）5xSDS-PAGE电泳缓冲液的配制:5SDS-PGE电泳谖冲液I1.TrisGIyCinC:甘刎酸）94gSDS5g将以上药品用去高子水溶解后定容到I1.-常涉保存.工作时用的是IXSDS-PA

8、GE电泳缓冲液。（十二）考/斯亮蓝R-25O染色液的配制：考乌斯亮蓝R-25O染色液I1.1 .往Ig考马斯克iR25O中参与25Om1.异丙醉，在破力搅拌器上搅拌六小时以上，2 .参与65OmI去离子水，破力搅扑器挽扑过夜，3 .再参与100m1.冰型酸进展溶解.极力挽抨器搅摔.4 .在通风橱内用谑纸进展过酒.常温保存.柒色液只能反究用两次“考前须知：在疏力搅拌器上搅拌时,要把容器封口。（十:）脱色液的配制:脱色液I1.除酸（冰乙酸）100mI乙醉（无水乙肿）50m1.去卷子水850m1.常温保存.四.试验步骤：（一）：质粒的转化I,运用无储操作台之前先用75%的酒精擦拭，然后将灭曲的培H柜

9、以及全部要用到的器具放到超净台上，在开紫外照楸30min左右.操作之前，关掉紫外，翻开通风树，将手用酒精擦拭后开场操作.2 .从-8（FC的冰箱中取出表达菌（B1.21）的感受态细胞（每管1001.）,ft-80冰水中溶化.3,载体（PET32a等）与基因片段的连接后期粒1.1.媛慢的参与到1001.B1.21感受态中.冰置15min.（无菌操作）3 .42C下热激90s,的后在冰水中冰置5min.4 .涂板：先将涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精灯火焰烧，放汽等它凉却.把处理后的感受态点在含有抗性的固体培育葩（定带或卡那等）上。用冷却的涂布棒进展涂布,左手把该盖拿起,小指轻轻也动培讦基，右手来涂

10、，涂到培育基外表快干。（无菌操作）5 .放在37C培育箱中，例置培育过夜。考前须知:1 .质粒的转化时.防粒是冻在-20C的冰箱中,等它完全化了在进展吸取.往好受态中参与项粒时，肯定要缓慢,因为感受态特别脆弱，防止通受态受伤.2 .质粒的转化时，热激的时间90s,肯定要限制好时间。3,质粒的转化时，涂布棒在涂布附，泞定要晾凉涂布棒”防止呼受态被烫死，或冏体培存基的损坏.（二）：挑薄与接曲：1 .无菌操作台紫外线照辘.后通风.符转化后的平板取出.2 .在无菌操作台中,把消毒后的螺口管（一般一个基因取四个螺n管,展平行试验）取出，在酒精灯的外焰上灼烧螺11管管口。3 .火苗格的1.B培育基从冰箱中

11、取出，在酒精灯的外馅上烧一下培育翦瓶口.吸取1.B培育基（Tftm1.）参与摞11管中.后参与抗性（氨不客素、卡那等）.显苇霉索（卡那）：1.B培百基=1.1.（XK）（1.）,抗性由教体确定.4 .镣子用酒精槌球擦拭，并在酒精灯的外焰上灼烧，将镣子脱凉，用脱冻的铅子，夹取2O1.小枪头，在转化后的平板上挑取单曲落,扰到培育基中.5 .接好菌的端口管.进展摇菌.37C.180rpm,摇到菌的对数期（0。,帆低），时间也许2-3h可以模相看到手即可.（留意不要摇过）6 .用完的平板用时口服时住，倒置放于4C保存。7 .假设干脆用曲液进展接茵，接阳比例为，阳液：1.B培育域=1：100,考前须知：

12、1 .接倒吸培H脸时，把放芭培闩基的三角就倾斜才吸取培白班，移液枪屋眼不要插进三角械中.2 .接函时肯定要参与抗性.挑曲落时.要挑单个的菌落.且不要把培育基也扣起来.3 .摇带不要过了它的对数期，2小时后随时留意其生长状态。（=）小量保菌：1 .无菌操作台紫外线照耀.后通风.2 .将擢到标准OD值的储液进展小演保的，先在酒精灯的外焰上灼烧蝶口管管口.3 .保萧：从灭菌的饭盒中取出4个的灭菌的离心管，参与501.的灭曲后的80%的甘油,并分别参与相应的350P1.菌液.一个基因的四个平行试验菌都要进展保苗.（假设不保苗,试验不能进展更复，只能从头做）4 .标消保郎的类别,名称，时间,如“B1.2

13、1PET32aVAV1号20211其中的1号是平行比照中它排几号.5 .混匀.-20C保存.考前须知：1 .在小境保阳中，一个基因的四个平行比照都要保储，否那么得重新换条件。2 .在小量保菌中.菌液与甘油肯定要混匀在保存,有那么菌会被冻死.（四）IS白诱导衣达条件摸索1 .无菌操作台紫2 .小盘保窗后的下进展i秀呼（如下列图外线照耀，后通风.四个平行试验组，分别参与不同终浓度的IPTG在不同的诏度条件）：比照编号IPTG终浓度疏导温度诱导温度1号1mmo!1.3h37C2号mmo1./1.3h37-C3号Immo1./1.3h30C4号m111.1.3h30,C（）小量收曲1.将诱导完成的四个

14、平行试脸组菌液,分别取HZm1.对应装于4个不同的离心管中并做好标记。剩余的平行试蛤祖带液放入4C保存。2.离心7000rpm.2min.使储沉淀.3.把上层培育基倒掉,用Im1.IXPBS把表达曲重昼，再次离心700OrPm,2min,使曲沉淀.4.把上层IXPBS倒掉，再次离心同步嶷3.5.用801.IxPBS把表达斯体重悬，6.在四个平行的垂悬液中，分别参与801.3SDS-PAGE1.oadingbuffer,（把3SDS-PAGE1.oadingbuffer当成2xSDS-PAGE1.oadingbuffer用）7.煮样8min.（糊开锅之煮）8.离心1300OrPm,IOmin,吸

15、上消.9.迸展SDS-PAGE电冰。考前须知：在点样时要胡开锅孟煮，防止小样进水，解设样进水，那么不能再用.（六）SDS-PAGE胶的配制1 .别肉股的配制（I）找出配套的胶板,用擦镜纸擦干冷，井也1定在配股器上,后用去离子水试漏.（2）假设胶板不漏水，就进展别离收的配制,依次将水、30%丙烯酰胺、Tris-Hc1.（）、10%SDS.10%过破酸侬加到干净的小烧杯中（如下列图）,混勾。（Imm的胶板，一般限一块股用5m1.所配的胶浓度一般为12%,但浓度也要视状况而定.蛋白越小，股的浓度越大.）SDS-PAGE分离胶配方表0、GH3O30%Ayi113!.5MTHCc*X1.!OSSOSw%

16、emaTFMFD3333,00321100o30300150.1500126940380150.150009S950380150150006Ie6002JO1.10.4&Ooo.6O0220663oo.a6O029ft46.o062Q,3aag1356OOO3B3有余166000S3JX*I19660002Q32sa16W60OO7SJNK3580OO1596075。303002413980750303001811910075030)0.012120030300121507603030012212ao10004040032Ig10710004040841S9133100040400161321

17、60100040400i92200WO0404001650555261012。23555打1312o87555M962000111SOSSSM（3）构胶板中的水倒掉,并用海纸吸干水分（不要将灌纸塞到胶板底部）.（4）小烧杯中再参与TEMED,混匀。（TEMED可使胶凝固,所以最终加）（5）灌胶：混匀的别离胶沿着胶板边缘轻轻灌卜，防止产生气泡。（6）用水将别离胶压平（用水淞满,同时加水时要缓慢参与,防止把股吹起）2 .浓缩股的配制（1）待别离肢与水中间形成明显的横线，即别离皎凝固。防后进展浓缩胶的配制，依次将水、30%丙烯酰胺、TriMHCI（）、10%SDS.10%过硫酸快加到干净的小烧杯中（

18、如下列图）SDS-PAGE浓缩胶（5%ACn1.amide）配方表香F怡号皎体飘及断G忖，&瞥，*材，1m1.2m1.3m1.4m1.HOo1421273441556830%AcryOmia90170330807OWVO13171.0MTri40.1302SC38050630.7510125IOa-SOS0010020030040C60060801Iosaeurs0.010020030040060060001TtMtO08100C20003OOCM00050006ooce001（2）将别岗Q2上层的水例抻，并用泄纸吸干水分，（尽量不要把港纸插入）（3）小烧杯中再参与TEMED,混匀.（4）港股

19、.然后捅入梳子。（5）把制胶器倒过来，股仍用不会往外流，或可以明显看出核子中两个齿之间的股面明显凹下去，说明浓缩胶凝固.将凝固的胶板装入电泳槽内，并在电泳槽内参与SDS-PAGE电泳馍冲液，把胶浸泡一段时间,时间越长越好。（防止梳子与股相连，或胶因湿度不好而萎缩）点样时，一把，子拔出来，拔时动作要轻,防止股齿被拔断.（七）未诱导和空载的制得在饯导表达中,有两个重要的比照组,即空载诱导和未诱导1 .未诱导的制备（1）未i导是我们所做1个法因除了四个平行试验外，再做的一个比照祖曲，唯一不同的是它不进展诱导（接菜步骤如上），在37TCK.进展摇的,不加IPTG,摇起来即可.（和表达完的茵浓度差不多即

20、可）（2）未诱导的菌进展小量处理，见上面的小1收菌.2 .空我诱导的制备（1）空载的转化：将不连基因片段的空载体质粒.转入表达菌（和前面的试验用一个表达萌）,如“B1.21-PET32a-VAV质粒”转入B1.21友达陆，其空载应当是“B1.21.-PET32a”转入B1.21表达曲”。转化步骤同上。（2）空载接一个黄（试粉组），并摇曲摇到对数期（步赚同上）.（3）空载的诱导：空统的诙导条件固定为温度37C,时间3h.,IPTG终浓度为Imm15 .上消和沉淀都进展煮样.开锅盅,Smin.16 .惠心13（）0OrPm.IOmin,吸上酒.17 .进展SDS电泳。考前须知：1 .小样超出时，要

21、树彻底，一般超45分钟即澄清.假设仍旧不澄清，那么可能是包涵体,超的过程中不要出糊.2 .在洗超声离心物的沉淀时，要洗干净.（一）被南闻声的SDS-PAGE电泳1.配股、点样、电泳的步骤如上。破倒超声的点样依次一般为:!23456marker未选导空投全苗破面上消破苗沉淀未疏导.空投,全苗为摸索友达条件时所用的样M.注：我们破的几号笛，就上几号的全曲样e2.假设破南上消表达的蛋白与全菌的蛋白分子盘一样（目的蛋白）,且破的沉淀中没有，这说明蛋白可溶：假设破菌沉淀中书目的蛋臼，而破面上清中没有,说明蛋白为包涵体.（卜二）目的蛋白的大量表达（I1.）1 .配制培育基11.,每大瓶500m1.高压灭菌

22、4匕保存.2 .一彼接曲：摸索完条件的衣达菌进展接菌3管，每管5m1.,抗性：培育基=1:1000,储液：培育携=1:100（阳液为针对可溶条件的小飞保带液）步骤如上。37X：,120pm,过夜播黄。3 .标准保菌：1P1.ySE倒株4.假设实在不行溶,只能把蛋白截短,这样可溶性会明显增加.六,SDS-PAGE的相关技巧:1. SDS-PAGE电冰的原理：SDS-聚丙笳酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯Itt股凝胶系统中引进SDS(十二烷基酸酸钠)，SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的累几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽友合物在内税悔胺凝胶电泳中的迁移率只

23、与多肽的大小有关,在到达饱和的状态下,每克多肽可与去污剂结合.当分子辰在I5KD到200KD之间时，蛋H质的迁移率和分子累的对数呈线性关系.符合下式：kgMW=KbX,式中：Mw为分子般，X为迂移率，k、b均为常数，假设将分子地的标准蛋白质的迁移率对分子量对故作图，可获得条标准曲城，未知蛋白质在一样条件下进展电泳,依据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求科分子Tia2. SDS-PGE电泳遇到的相关何胭及解答，(1)配股缓冲液系统对电泳的影响？在SDS-PAGE不连续电泳中.制胶缓冲液运用的是TriS-HC1.线冲系统,浓缩胶是,别离胶;而电泳谖冲液运用的TriS一甘敏酸缓冲系统。在浓缩股中，其P

24、H环境早.弱酸性，因此甘氨酸解肉很少，其在电场的作用下，泳动效率低：而C1.离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动.由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋向质分子聚集铛一起，浓缩为一狭窄的区带，当样品iS入别离胶后，由于胶中PH的增加，呈碱性，甘朝酸大琏解离，泳动速率增加,干脆紧随氧离子之后，同时由于别离胶孔径的缩小，在电场的作刖下,蛋白分子依据其冏有的带电性和分子大小进展别国.所以，PH对整个反响体系的影响是至关重要的，试验中在解除其他因素之后仍不能很好解决问咫的状况，应首要考虑该因素。12；提高SDS-PAGE电泳辨别率的途径?聚丙

25、烯Itt胺的充分聚合，可提岛凝胶的辨别率.建议做法：待凝胶在室温凝囿后，可在室温下放置段时间运用，忌即配即用或4度冰箱放冏，前者易好致凝固不充分，后者可导致SDS结品。一般液胶可在室温下保存4天，SDSUJ水解聚丙烯酰股.(4) “澈笑”(两边翘起中间凹下)形带缘由？主要是由于凝胶的中间局部凝固不匀称所致，多出现于软厚的凝胶中。处理方法：待其充分邀囚再作后续试验.(5) “皱眉.(两边向下中间鼓起)形带缘由？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未解除干净.处理方法：可在两板间参与适量缓冲液以解除气泡.(6)为什么带出现拖足现象？主要是样品融解效果不佳或别离肢浓度过大弓I起

26、的。处理方法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液,加适量样品便溶剂：电泳缓冲液时间过长,重新配制：降低凝胶浓度.(7)为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的.处理方法：加样前禹心：加适盘样品促溶剂。（8）什么是“鬼带,如何处理？“鬼带就是在跑大分子构象困难的蛋白质分子时.常会出现在泳道顶端（有时在浓缩收中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于亚原剂在加热的过程中被乳化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子常新折郎结合和亚基更新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入别图股.但它却于目标条带有一样的免疫学活性，在WB反响中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理方法:在加热沸3M添切透盘的DTT或BeIa筑基乙H?.以补充映乏的复原剂：或可加适hiEDTA来阻档史原剂的氧化.（9）为什么漠酚减不能起到指示作用？我们在试脸中常会遇到双的蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象.主要与缓冲液和别离胺的浓度有关.处理方法：更换正确PH值的BUffer：降低别离股的浓度，（10）为什么电泳的条带很粗?电泳中条指很粗是常见的事，主要是未浓缩好的经由，处理方法：适当增加浓缩股的长度；保证浓缩胶贮液的PH正确（）；适当降低电压，