猪去氧胆酸对脂肪变性肝细胞活性的影响及其机制.docx

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1、脂肪性肝病l：10.1244azJCH240212猪去氧胆酸对脂肪变性肝细胞活性的影响及其机制汪远远他,2,邹艳，刘朝霞3,2,阳学风1南华大学附属南华医院a.消化内科，b.手足外科，湖南衡阳4210022湖南省代谢相关脂肪性肝病临床研究中心，湖南衡阳421002通信作者：阳学风，yxf009988(ORCID:0000-0002-3470-0350)摘要：目的探讨猪去氧A旦酸(HDCA)在代谢相沟旨肪性肝病(MAFLD)发展中的作用及机制，为击步阐明MAFLD的发病机制提供新的理论依据.方法L02肝细胞作为实验细胞，利用棕植)酸诱导L02细胞发到旨肪变性.采用FXRSiRNA干扰翩沐，构建F

2、XR仍表的肝细胞株。CCK8实验检测HDCA在不同浓度(0、100、200、300、400moVL)和时间(12、24、36、48h)对L02脂影响HiiqRTFCR检测法国X哪(FXR)、增蒯胞(PCNA八醐蛋白D1(CyclinD1)、磷月享-3缄(PI3K)码白僦B(AKT)mRNA辘;WesternBlot撷。FXRxCydinD1、PCNAPI3Kp-PI3K、AKT和P-AKT蛋白表达。计量资料服从正态分布且方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用TukeyHSD检验；服从正态分布但方差不齐时采用Welch方差分析，进一步两两匕限采用Games-Howell检验。两

3、组间比较采用成组f检验。结果CCK8检测结果显示，300molLHDCA处理的L02细胞和脂肪变性肝细胞活性明显下降(P值均0.05)IqRT-PCR检测结果显示，FXRmRNA表达增强，PCNAxCyclinD1、PI3KxAKT的mRNA表达下降，差异均有统计学意义(产值均0.05)WesternBtot检测结果显示，FXR蛋白表达明显上升(P0.05);干扰L02细胞FXR的表达后，PCNA.PI3KxP-PI3K、AKT和P-AKT的蛋白表达均明显增力(产值均0.05).结论HDCA通过上调FXR表达十制PI3K/AKT信号通路，从而造成脂肪变性肝细胞活性下降。关键词：代谢相关脂肪性肝

4、病；猪去氧胆酸；法尼醇X受体基金项目：湖南省教育厅一般项目(20C1586)；湖南省科技创新计划项目(2020SK51910,2021SK51902)EffectofhyodeoxycholicacidontheactivityofsteatosishepatocytesanditsmechanismWANGYuanyuan1a2,ZOUYan1b,LIUZhaoxiala,2,YANGXuefengla,2.(1.a.DepartmentofGastroenterology,b.DepartmentofHandandFootSurgery,NanhuaHospitalAffiliatedto

5、UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421002,China;2.HunanProvincialClinicalResearchCenterforMetabolicAssociatedFattyLiverDisease,Hengyang,Hunan4210021China)Correspondingauthor:YANGXuefeng,yxf009988(ORCID:0000-0002-3470-0350)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheroleandmechanismofhyodeoxycholicacid(HDCA)

6、intheprogressionofmetabolicassociatedfattyliverdisease(MAFLD),andtoprovideanewtheoreticalbasisforfurtherclarifyingthepathogenesisofMAFLD.MethodsL02hepatocyteswereusedasexperimentalCenS,andpalmiticaddwasusedtoindusteatosisinL02cells.ThefamesoidXreceptor(FXR)siRNAinterferenchaintechniquewasusedtoconst

7、ructahepatocytecelllinewithlowFXRexpressi.CCK8assaywasusedtoobservetheeffectofHDCAonL02steatosishepatocytesatCifferentconcentrations(0,100,200,300,and400mdL)andtimepoints(12,24,36,and48hours).ThemethodofqRT-PCRwasusedtomeasurethemRNAexpressionlevelsofFXR,proliferatingcelnudearantigen(PCNA),CydinD1,p

8、hosphatidylinositol3-kinase(PI3K),andproteinkinase-B(AKT),andWesternWotwasusedtomeasuretheproteinexpressionlevelsofFXR,CydinD1fPCNA,PBK,phosphorylatedPI3K(p-PI3K),AKT,andphosphoryiated(p-AKT).Aone-wayanalysisofvarianwasusedforcomparisorofncxmaJlydistributedntinuousdatawithhomogeneityofvarianbetweenm

9、ultplegroups,andtheTukeyHSDtestwasusedforfurthercomparisbetweentwogroups;theWelchanalysisofvariancewasusedforcomparisofncnaiydistributedntinusdataWrthheterogeneityofvariancebetweenmultiplegroups,andtheGames-Howelltestwasusedforfurthercomparisbetweentwogroups.Theindependent-samplesttestwasusedforcomp

10、arisonbetweentwogroupsResultsCCK8assayshowedasignificantreductioninteviabilityofL02cellsandsteatosishepatocytestreatedby300mo(LHDCA(P0.05),andqRT-PCRshowedaSignifiCantincreaseinthemRNAexpressionlevelofFXRandsignificantreductionsinthemRNAexpressionlevelsofPCNA,CydinDl,PBK,andAK(allPQ05).Westanblotsho

11、wedasignificantincreaseintheproteinexpressilevelofFRX(P0,05),andafterinterferenceofFXRexpressioninL02cells,thereweresignificantincreasesintheproteinexpressionlevelsfPCNA,PBK,p-PI3K,AKT,andp-AKT(allP0.05).CondusionHDCAinhibitsthePI3KAKTsignalingpathwaybyUpregulatingFXRexpression,therebyinducingareduc

12、tionintheviabilityofsteatosishepatocytes.Keywords:Metabolism-AssociatedFattyLiverDisease;HyodycholicAdd;FamesoidXReceptorResearchfunding:GeneralProjectofHunanProvincialEducationDepartment(20C1586);HunanProvincialScienceandTechnologyInnovationProgramProject(2020SK51910,2021SK51902)目前，代湘沟旨雌肝病(metaboli

13、sm-associatedfattyliverdiseasefMAFLD)已成为我国慢性肝病的第一大原因，患病率高达30%,且预计仍会进一步升高m。MAFLD与代谢性疾病发病密切相关，如肥胖、高血压、2型糖尿病以及心血管疾病等12)。脂质代谢异常是MAFLD的关键问题之一【3肝脏的脂肪酸大多来自脂肪中甘油三酯分解，通过血液循环至肝脏吸收41o胆汁酸由胆固醇代谢产生，可以通过激活肝脏内的法尼醇X受体(farnesoidXreceptor,FXR),调节脂肪酸合成、氧化和运输等过程，从而影响脂肪代谢斗。笔者预实验通过质谱分析发现猪去氧胆酸(hyodeoxycholicacid,HDCA)在MAFL

14、D患者的血液和粪便样本中含量明显高于健康人，但HDCA在MAFLD发病中的作用及机制尚不清楚本课题组采用棕楣酸(palmiticacid,PA)诱导L02细胞构幽旨肪变性肝细胞模型，分析HDCA对脂肪变性肝细胞活性的影响；并构建FXR低表达肝细胞株，研究HDCA是否通过FXR-PBK/AKT途径对脂肪变性肝细胞的活性发挥作用，从而探讨HDCA在MAFLD发生发展中的作用及其机制，为MAFLD的预防和治疗提供新途径。1材料与方法1.1细胞培养L02细胞(HL7702)购自上海佰晔生物科技公司。DMEM高糖完全培养基包含10%胎牛血清(FBS)和1%青链霉素混合液(XlOo),L02细胞接种于25

15、cm2底面积的培养瓶中，置于37、5%CO2的细胞培养箱内培养0.2mmol/L的PA诱导L02细蒯旨肪变性。1.2PA的配置取25.642mgPA加入至ImL无水乙醇中水浴加热，配得浓度为100mmol/L的PA溶液。另取50mg无三肪酸牛血清白蛋白(BSA)加入至10mL1640培养基中并混匀，配得BSA浓度为0.5%。PA溶液取0.2mL加入至9.7mL的BSA与1640培养基的混合液中，配得浓度为2mmol/L的PA溶液然后将PA溶液置于55水浴锅中水浴30min细菌滤过器过滤除菌两次.过滤后的PA溶液与完全培养基按照体积比1：9混合稀释10倍配置成0.2mmol/L的PA混合液e剩余

16、的PA溶液按照每次实验预估用量分装，-20C冰箱储存。1.3HDCA的配置20mg的HDCA溶于100L的二甲基亚砚(DMSO),震荡混匀直至完全溶解，配置成浓度510molL的HDCA溶液HDCA溶液取8L,加入992L含10%FBS的DMEM高糖完全培养基,配置成浓度为4000molL的HDCA溶液。HDCA溶液与完全培养基按照体积比1：9稀释10倍配置成浓度AOQmoL的HDCA溶液。100、200、300molL的HDCA溶液从HDCA溶液逐步稀释400molL的HDCA溶液中DMSO的含量为0.08%,低于DMSO对细胞安全界限01%,故本实验不设立DMSO对照组。剩余的HDCA溶液

17、，标记时间和药品名称，密封放入-20冰箱冻存，避免反复冻融。1.4 细胞活性测定用CCK8试剂测定细胞活性，每100LDMEM完全培养基力口入10LCCK8试齐!1混匀。吸弃原液，每孔加入100L的混合液，将96孔板置于37细麒养箱中艇0.52h,新被测量450/62Onm处的光密度(OD)值。细胞活性计算公式如下：细胞活性()=OD(力喷)QD(空白组)OD(正翼)-C)D空白组)lOO%.1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)将L02细胞接种于6孑嫉，PA诱导24h后，HDCA姐里24h。i三qRT-PCR酬L02iTOFXR,增建田胞(PCNA).周期蛋白Dl(CyclinDl)、

18、磷月旨酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白虢B(AKT)的mRNA三弓物(表1)大部分原于PrimerBank(6),部分引物参考的编码序列设计来源于NCBI基因(存在多个转录本时，可对各转录本的保守区域进行引物设计),并以GAPDH作为内参基因。所有引物均在PrimeBlast中验证了其特异性。合成由长沙鼎国生物科技有限公司完成。1.6 WesternBlot处理后的L02脂肪变性肝细胞用含有表1qRT-PCR引物序列Table1qRT-PCRprimersequences引物阚（59）FXR上游：Aaccatactcgcaatacagcaa下游：ACAGCTCATCCTTTGATCCPCNA

19、i?：Cctgctgggatattagctcca榜:CAGCGGTAGGTGTAAGCCydinD1:GCTGCXaAAGTGGAAACCATC下游:TCCTTCTGCACACATTTGAAPI3K：Tatttggactttgcgacaagact下游：TcgaacgtactggtctggatagAKT-F：Agcgacgtggctattgtgaag下游：Gccatcattcttgaggaggaagt蛋白酶抑制剂复合物的冷RIPA缓冲液裂解o收集上清液，12OooXg离心15min,使用BCA检测i翻翻层总蛋白球。蹒体刨舌FXR（1：1500）、PCNA（1:2000）、QdiDI（1:2000

20、）、PCK（1:2000）、pR3K（1:1500）、AKr（I:2000）、PAKT（1:1500）和GAPDH（1:2000）o条带采用ImageJ软件进行密度分析。1.7 FXRsiRNAFXRsiRNA依据其基因阚（的来源参考NCBIGeneBank健库在广州市锐博生物科技有限公司设计并合成3条特异性干扰链。细胞密度达到50%,进行转染。配置混合转染试剂：5LLipofectamine3000转染试剂+5LFXRsiRNA混匀，室温静置30min0混合的转染试剂加入L02细胞，转染时间2448h。弃去原有的培养液，PBS洗涤并更换新的不含双抗的培养基。提取6孔板细胞的总RNA,qRT-

21、PCR方法检测3条FXRSiRNA干扰链作用下，FXRmRNA的表达情况并分析表达差异.选择FXRmRNA降低最明显的一条作为实验干扰组。1.8 统计学方法所有实验数据均使用仙桃学术进行统计分析。计量资料以fs表示，服从正态分布且方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用TukeyHSD检验；服从正态分布但方差不齐时采用Welch方差分析，进一步两两匕啜采用Games-Howell检验.两组间比较采用成组f检验。尸0.05为差异有统计学意义。2结果2.1脂肪变性肝细胞模型的构建及PA对肝细胞活性的影响采用甘油三酯含量测定和油红O染色方法观察肝细胞脂肪变性模型是否构建成功。结果显示

22、油红O染色后，显微镜下观察到L02细胞组细胞质中没有大的红色脂滴，在细胞膜上存在小而均匀的红色脂滴；PA诱导的L02细胞组中细胞质内存在明显的大而深红色的脂滴（图1）；与Oh比较，L02细胞在PA诱导后不同时间段甘油三酯水平有不同程度的升高（图2）,表明模型构建稳定，将构建成功的脂肪变性肝细胞定义为M组进行后续研究。CCK8实验检测显示，PA诱导L02细胞24h后细胞活性明显下降（1.0000.084vs0.6680.022,t=-18.663,FkO.001）.注：a,PA诱导前辟IO染色;b,PA诱导后24h港IO染色图1油红。染色结果（20）Figure1Resultsoftheoilr

23、edOstaining.O.5Q.52.1.LO- 二 HOEE) Mlll!HOO1:PQ,OJL0.01-e三3L-JLrJljUJ-Oh12h24h36h48h图2PA诱导L02细胞后甘油三酯水平随时间的变化Figure2ChangesintriglyceridelevelsovertimeafterPAinductioninLO2cells2.2HDCA对正常肝细胞及脂肪变性肝细胞活性的影响为了研究HDCA对脂肪变性肝细胞的影响，将不同浓度的HDCA加入L02细胞和脂肪变性肝细胞。CCK8实验检测结果显示，与L02细胞组相比，L02+100molLHDCA组和L02+200molLHD

24、CA组中L02细胞活性没有改变，L02+300molLHDCA组和L02+400molLHDCA组中L02细胞活性明显下降（P值均0.001）（图3a）。与M组相比，M+100moVLHDCA组和M+200molLHDCA组细胞活性无明显改变,M+300molLHDCA组和M+400molLHDCA组细胞活性均显著降低（户值均0001）（图3b）。以上实验证明300molL的HDCA抑制了L02细胞和脂肪变性肝细胞活性。为了观察随着300molLHDCA处理时间的延长，脂肪变性肝细胞的活性是否发生改变，通过CCK8检测结果显示，M+300molLHDCA组细胞活性随时间的变化而发生改变（P值均

25、0OoI）（图3c）。后续实验HDCA浓度均采用300molL泥9E 6 4 cio.o. l紫密指标M组M+HDCAf值产值FXR mRNA0.485+0. 1621.010+0.0135.5760. 5PCNAmRNA1.710+0.0521.03410.054-15.679 0. 1Cyclin D1 mRNA1.435+0. 1241.041i0.053-5.0830.007PI3KmRNA1.9510.5001.008+0.009-3.2660.031AKT mRNA2.3730. 3161.030+0.050-7.2660.002表2 HDCA对月旨肪变性肝名田胞FXR、PI3K、

26、AKT、PCNA和 Cyclin D1 mRNA表达的膨响Table 2 Effect of HDCA on the mRNA expression of FXR1PI3K, AKT, PCNA, and Cyclin D1 in Steatotic hepatocytes0.0LIII12h24h36h48h注：a,不同浓度HDCA对L02细胞活性的影响；b,不同浓度HDCA对PA语时脂肪变的；c,HDCA（300molL）不同时间对PA诱导的脂肪变性肝细胞活性的膨响。图3HDCA对正常肝细胞及脂肪变性肝细胞活性的影响Figure3EffectofHDCAontheactivityofnor

27、malhepatytesandsteatosishepatocytes2.3HDCA对脂肪变性肝细胞FXR-PI3KAKT通路关键分子及PCNA和CyclinD1表达的影响为了进一步研究HDCA（300mol儿）抑制脂肪变性肝细胞活性的机制，通过WesternBIot检测发现，M+HDCA组中FXR雷白的表达高于M组（t=4.492,尸0.05）（图4）。qRT-PCR检测M组和M+HDCA组的FXR、PCNAxCyclinDl以及PI3KAKT通路关键分子mRNA的表达变化，结果显示，相比于M组，M+HDCA组中FXRmRNA表达升高，PCNAnCyclinD1、PI3K和AKTmRNA表达

28、均明显下降（P值均0.05）（表2）。2.4FXR低表达肝细胞株的构建及HDCA对脂肪变性肝细胞FXRmRNA表达的影响为了验证HDCA（300molL）是否通过FXR抑制脂肪变性肝细胞活性，选择干扰FXR骄，在3条FXRsiRNA（FXRsiRNA1、2、3）扰效果最强的干扰链。结果如图5a所示,相比于M组，M+FXRsiRNA3的（P0.01）qRT-PCR检测FXRSiRNA3干扰链对HDCA刺激脂肪变性肝细胞FXRmRNA表达妍扰效果，结期示，相比于M+HDCA组,M+FXRsiRNA3+HDCA组的FXRmRNA表达水平B胭降（氐（尸AKT蛋白趣增加，差异均有统计学意义（户值均CNA

29、CyclinDlPI3Kp-W3KAKT， O S.O， 2.z1 .Lo.*S*R5C JP-AKTGAPDH畀备修ftwNJd3 2 1H-长EXEftcQ.01 po.o fiLflI力OQl po.o jLlw-wi!J*B兴AP0.05- 05 po.osS注：a,FXRPCNACycinD1、PI3Kp-Pt3KAKT和PAKT的蛋白E睡图；b,FXR蛋白的幽族达水平;C,PCNA蛋白的瞰俵达水平；d,CycinD1蛋白的相对表达水平；e,PI3K蛋白的相对表达水平；f,p-PI3K蛋白的相对表达水平；g,AKT蛋白的相对表达水平；h,P-AKT蛋白的相对表达水平。图6抑制FXR表

30、达后脂肪变性肝细胞FXR-PI3K/AKT通路关键分子及PCNA和CyclinDl蛋白表达的变化Figure 6 ChangesintheexpressionofkeymoleculesofFXR-PI3KAKTpathwayandPCNAandCyclinD1proteinsinsteatosishepatocytesafterinhibitionofFXRexpression利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。作者贡献声明：汪远远负责实验设计和实施，撰写论文；邹艳负责数据收集与分析；刘朝霞负责图表制作；阳学风指导撰写文章并最后定稿。参考文献：1 ESLAMM.SANYALAJ.GEORG

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