猪去氧胆酸对脂肪变性肝细胞活性的影响及其机制.docx

脂肪性肝病l：10.1244azJCH240212猪去氧胆酸对脂肪变性肝细胞活性的影响及其机制汪远远他,2,邹艳，刘朝霞3,2,阳学风1南华大学附属南华医院a.消化内科，b.手足外科，湖南衡阳4210022湖南省代谢相关脂肪性肝病临床研究中心，湖南衡阳421002通信作者：阳学风，yxf009988(ORCID:0000-0002-3470-0350)摘要：目的探讨猪去氧A旦酸(HDCA)在代谢相沟旨肪性肝病(MAFLD)发展中的作用及机制，为击步阐明MAFLD的发病机制提供新的理论依据.方法L02肝细胞作为实验细胞，利用棕植)酸诱导L02细胞发到旨肪变性.采用FXRSiRNA干扰翩沐，构建FXR仍表的肝细胞株。CCK8实验检测HDCA在不同浓度(0、100、200、300、400moVL)和时间(12、24、36、48h)对L02脂影响HiiqRTFCR检测法国X哪(FXR)、增蒯胞(PCNA八醐蛋白D1(CyclinD1)、磷月享-3缄(PI3K)码白僦B(AKT)mRNA辘;WesternBlot撷。FXRxCydinD1、PCNAPI3Kp-PI3K、AKT和P-AKT蛋白表达。计量资料服从正态分布且方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用TukeyHSD检验；服从正态分布但方差不齐时采用Welch方差分析，进一步两两匕限采用Games-Howell检验。两组间比较采用成组f检验。结果CCK8检测结果显示，300molLHDCA处理的L02细胞和脂肪变性肝细胞活性明显下降(P值均0.05)IqRT-PCR检测结果显示，FXRmRNA表达增强，PCNAxCyclinD1、PI3KxAKT的mRNA表达下降，差异均有统计学意义(产值均0.05)WesternBtot检测结果显示，FXR蛋白表达明显上升(P0.05);干扰L02细胞FXR的表达后，PCNA.PI3KxP-PI3K、AKT和P-AKT的蛋白表达均明显增力(产值均0.05).结论HDCA通过上调FXR表达十制PI3K/AKT信号通路，从而造成脂肪变性肝细胞活性下降。关键词：代谢相关脂肪性肝病；猪去氧胆酸；法尼醇X受体基金项目：湖南省教育厅一般项目(20C1586)；湖南省科技创新计划项目(2020SK51910,2021SK51902)EffectofhyodeoxycholicacidontheactivityofsteatosishepatocytesanditsmechanismWANGYuanyuan1a2,ZOUYan1b,LIUZhaoxiala,2,YANGXuefengla,2.(1.a.DepartmentofGastroenterology,b.DepartmentofHandandFootSurgery,NanhuaHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421002,China;2.HunanProvincialClinicalResearchCenterforMetabolicAssociatedFattyLiverDisease,Hengyang,Hunan4210021China)Correspondingauthor:YANGXuefeng,yxf009988(ORCID:0000-0002-3470-0350)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheroleandmechanismofhyodeoxycholicacid(HDCA)intheprogressionofmetabolicassociatedfattyliverdisease(MAFLD),andtoprovideanewtheoreticalbasisforfurtherclarifyingthepathogenesisofMAFLD.MethodsL02hepatocyteswereusedasexperimentalCenS,andpalmiticaddwasusedtoindusteatosisinL02cells.ThefamesoidXreceptor(FXR)siRNAinterferenchaintechniquewasusedtoconstructahepatocytecelllinewithlowFXRexpressi.CCK8assaywasusedtoobservetheeffectofHDCAonL02steatosishepatocytesatCifferentconcentrations(0,100,200,300,and400mdL)andtimepoints(12,24,36,and48hours).ThemethodofqRT-PCRwasusedtomeasurethemRNAexpressionlevelsofFXR,proliferatingcelnudearantigen(PCNA),CydinD1,phosphatidylinositol3-kinase(PI3K),andproteinkinase-B(AKT),andWesternWotwasusedtomeasuretheproteinexpressionlevelsofFXR,CydinD1fPCNA,PBK,phosphorylatedPI3K(p-PI3K),AKT,andphosphoryiated(p-AKT).Aone-wayanalysisofvarianwasusedforcomparisorofncxmaJlydistributedntinuousdatawithhomogeneityofvarianbetweenmultplegroups,andtheTukeyHSDtestwasusedforfurthercomparisbetweentwogroups;theWelchanalysisofvariancewasusedforcomparisofncnaiydistributedntinusdataWrthheterogeneityofvariancebetweenmultiplegroups,andtheGames-Howelltestwasusedforfurthercomparisbetweentwogroups.Theindependent-samplesttestwasusedforcomparisonbetweentwogroupsResultsCCK8assayshowedasignificantreductioninteviabilityofL02cellsandsteatosishepatocytestreatedby300mo(LHDCA(P<0.05),andqRT-PCRshowedaSignifiCantincreaseinthemRNAexpressionlevelofFXRandsignificantreductionsinthemRNAexpressionlevelsofPCNA,CydinDl,PBK,andAK(allP<Q05).WestanblotshowedasignificantincreaseintheproteinexpressilevelofFRX(P<0,05),andafterinterferenceofFXRexpressioninL02cells,thereweresignificantincreasesintheproteinexpressionlevelsfPCNA,PBK,p-PI3K,AKT,andp-AKT(allP<0.05).CondusionHDCAinhibitsthePI3KAKTsignalingpathwaybyUpregulatingFXRexpression,therebyinducingareductionintheviabilityofsteatosishepatocytes.Keywords:Metabolism-AssociatedFattyLiverDisease;Hyod×ycholicAdd;FamesoidXReceptorResearchfunding:GeneralProjectofHunanProvincialEducationDepartment(20C1586);HunanProvincialScienceandTechnologyInnovationProgramProject(2020SK51910,2021SK51902)目前，代湘沟旨雌肝病(metabolism-associatedfattyliverdiseasefMAFLD)已成为我国慢性肝病的第一大原因，患病率高达30%,且预计仍会进一步升高m。MAFLD与代谢性疾病发病密切相关，如肥胖、高血压、2型糖尿病以及心血管疾病等12)。脂质代谢异常是MAFLD的关键问题之一【3肝脏的脂肪酸大多来自脂肪中甘油三酯分解，通过血液循环至肝脏吸收41o胆汁酸由胆固醇代谢产生，可以通过激活肝脏内的法尼醇X受体(farnesoidXreceptor,FXR),调节脂肪酸合成、氧化和运输等过程，从而影响脂肪代谢斗。笔者预实验通过质谱分析发现猪去氧胆酸(hyodeoxycholicacid,HDCA)在MAFLD患者的血液和粪便样本中含量明显高于健康人，但HDCA在MAFLD发病中的作用及机制尚不清楚本课题组采用棕楣酸(palmiticacid,PA)诱导L02细胞构幽旨肪变性肝细胞模型，分析HDCA对脂肪变性肝细胞活性的影响；并构建FXR低表达肝细胞株，研究HDCA是否通过FXR-PBK/AKT途径对脂肪变性肝细胞的活性发挥作用，从而探讨HDCA在MAFLD发生发展中的作用及其机制，为MAFLD的预防和治疗提供新途径。1材料与方法1.1细胞培养L02细胞(HL7702)购自上海佰晔生物科技公司。DMEM高糖完全培养基包含10%胎牛血清(FBS)和1%青链霉素混合液(XlOo),L02细胞接种于25cm2底面积的培养瓶中，置于37、5%CO2的细胞培养箱内培养0.2mmol/L的PA诱导L02细蒯旨肪变性。1.2PA的配置取25.642mgPA加入至ImL无水乙醇中水浴加热，配得浓度为100mmol/L的PA溶液。另取50mg无三肪酸牛血清白蛋白(BSA)加入至10mL1640培养基中并混匀，配得BSA浓度为0.5%。PA溶液取0.2mL加入至9.7mL的BSA与1640培养基的混合液中，配得浓度为2mmol/L的PA溶液然后将PA溶液置于55水浴锅中水浴30min细菌滤过器过滤除菌两次.过滤后的PA溶液与完全培养基按照体积比1：9混合稀释10倍配置成0.2mmol/L的PA混合液e剩余的PA溶液按照每次实验预估用量分装，-20°C冰箱储存。1.3HDCA的配置20mg的HDCA溶于100L的二甲基亚砚(DMSO),震荡混匀直至完全溶解，配置成浓度5×10molL的HDCA溶液HDCA溶液取8L,加入992L含10%FBS的DMEM高糖完全培养基,配置成浓度为4000molL的HDCA溶液。HDCA溶液与完全培养基按照体积比1：9稀释10倍配置成浓度AOQmoL的HDCA溶液。100、200、300molL的HDCA溶液从HDCA溶液逐步稀释400molL的HDCA溶液中DMSO的含量为0.08%,低于DMSO对细胞安全界限01%,故本实验不设立DMSO对照组。剩余的HDCA溶液，标记时间和药品名称，密封放入-20冰箱冻存，避免反复冻融。1.4 细胞活性测定用CCK8试剂测定细胞活性，每100LDMEM完全培养基力口入10LCCK8试齐!1混匀。吸弃原液，每孔加入100L的混合液，将96孔板置于37细麒养箱中艇0.52h,新被测量450/62Onm处的光密度(OD)值。细胞活性计算公式如下：细胞活性()=OD(力喷§)QD(空白组)OD(正翼§)-C)D空白组)lOO%.1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)将L02细胞接种于6孑嫉，PA诱导24h后，HDCA姐里24h。i三qRT-PCR酬L02iTOFXR,增建田胞(PCNA).周期蛋白Dl(CyclinDl)、磷月旨酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白虢B(AKT)的mRNA三°弓物(表1)大部分原于PrimerBank(6),部分引物参考的编码序列设计来源于NCBI基因(存在多个转录本时，可对各转录本的保守区域进行引物设计),并以GAPDH作为内参基因。所有引物均在PrimeBlast中验证了其特异性。合成由长沙鼎国生物科技有限公司完成。1.6 WesternBlot处理后的L02脂肪变性肝细胞用含有表1qRT-PCR引物序列Table1qRT-PCRprimersequences引物阚（59）FXR上游：Aaccatactcgcaatacagcaa下游：ACAGCTCATCCTTTGATCCPCNA±i?：Cctgctgggatattagctcca榜:CAGCGGTAGGTGTAAGCCydinD1:GCTGCXaAAGTGGAAACCATC下游:TCCTTCTGCACACATTTGAAPI3K：Tatttggactttgcgacaagact下游：TcgaacgtactggtctggatagAKT-F：Agcgacgtggctattgtgaag下游：Gccatcattcttgaggaggaagt蛋白酶抑制剂复合物的冷RIPA缓冲液裂解o收集上清液，12OooXg离心15min,使用BCA检测i翻翻层总蛋白球。蹒体刨舌FXR（1：1500）、PCNA（1:2000）、QdiDI（1:2000）、PCK（1:2000）、pR3K（1:1500）、AKr（I:2000）、PAKT（1:1500）和GAPDH（1:2000）o条带采用ImageJ软件进行密度分析。1.7 FXRsiRNAFXRsiRNA依据其基因阚（的来源参考NCBIGeneBank健库在广州市锐博生物科技有限公司设计并合成3条特异性干扰链。细胞密度达到50%,进行转染。配置混合转染试剂：5LLipofectamine3000转染试剂+5LFXRsiRNA混匀，室温静置30min0混合的转染试剂加入L02细胞，转染时间2448h。弃去原有的培养液，PBS洗涤并更换新的不含双抗的培养基。提取6孔板细胞的总RNA,qRT-PCR方法检测3条FXRSiRNA干扰链作用下，FXRmRNA的表达情况并分析表达差异.选择FXRmRNA降低最明显的一条作为实验干扰组。1.8 统计学方法所有实验数据均使用仙桃学术进行统计分析。计量资料以f±s表示，服从正态分布且方差齐时多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用TukeyHSD检验；服从正态分布但方差不齐时采用Welch方差分析，进一步两两匕啜采用Games-Howell检验.两组间比较采用成组f检验。尸0.05为差异有统计学意义。2结果2.1脂肪变性肝细胞模型的构建及PA对肝细胞活性的影响采用甘油三酯含量测定和油红O染色方法观察肝细胞脂肪变性模型是否构建成功。结果显示油红O染色后，显微镜下观察到L02细胞组细胞质中没有大的红色脂滴，在细胞膜上存在小而均匀的红色脂滴；PA诱导的L02细胞组中细胞质内存在明显的大而深红色的脂滴（图1）；与Oh比较，L02细胞在PA诱导后不同时间段甘油三酯水平有不同程度的升高（图2）,表明模型构建稳定，将构建成功的脂肪变性肝细胞定义为M组进行后续研究。CCK8实验检测显示，PA诱导L02细胞24h后细胞活性明显下降（1.000±0.084vs0.668±0.022,t=-18.663,FkO.001）.注：a,PA诱导前辟IO染色;b,PA诱导后24h港IO染色图1油红。染色结果（20）Figure1ResultsoftheoilredOstaining.O.5Q.52.1.LO- 二 HOEE) M¼lll!HOO1:P<Q,OJL0.01-e三3L-JLrJljUJ-Oh12h24h36h48h图2PA诱导L02细胞后甘油三酯水平随时间的变化Figure2ChangesintriglyceridelevelsovertimeafterPAinductioninLO2cells2.2HDCA对正常肝细胞及脂肪变性肝细胞活性的影响为了研究HDCA对脂肪变性肝细胞的影响，将不同浓度的HDCA加入L02细胞和脂肪变性肝细胞。CCK8实验检测结果显示，与L02细胞组相比，L02+100molLHDCA组和L02+200molLHDCA组中L02细胞活性没有改变，L02+300molLHDCA组和L02+400molLHDCA组中L02细胞活性明显下降（P值均0.001）（图3a）。与M组相比，M+100moVLHDCA组和M+200molLHDCA组细胞活性无明显改变,M+300molLHDCA组和M+400molLHDCA组细胞活性均显著降低（户值均0001）（图3b）。以上实验证明300molL的HDCA抑制了L02细胞和脂肪变性肝细胞活性。为了观察随着300molLHDCA处理时间的延长，脂肪变性肝细胞的活性是否发生改变，通过CCK8检测结果显示，M+300molLHDCA组细胞活性随时间的变化而发生改变（P值均0OoI）（图3c）。后续实验HDCA浓度均采用300molL«泥9E£ 6 4 cio.o. «l紫密指标M组M+HDCAf值产值FXR mRNA0.485+0. 1621.010+0.0135.5760. 5PCNAmRNA1.710+0.0521.03410.054-15.679 <0. 1Cyclin D1 mRNA1.435+0. 1241.041i0.053-5.0830.007PI3KmRNA1.951±0.5001.008+0.009-3.2660.031AKT mRNA2.373±0. 3161.030+0.050-7.2660.002表2 HDCA对月旨肪变性肝名田胞FXR、PI3K、AKT、PCNA和 Cyclin D1 mRNA表达的膨响Table 2 Effect of HDCA on the mRNA expression of FXR1PI3K, AKT, PCNA, and Cyclin D1 in Steatotic hepatocytes0.0LIII12h24h36h48h©注：a,不同浓度HDCA对L02细胞活性的影响；b,不同浓度HDCA对PA语时脂肪变的；c,HDCA（300molL）不同时间对PA诱导的脂肪变性肝细胞活性的膨响。图3HDCA对正常肝细胞及脂肪变性肝细胞活性的影响Figure3EffectofHDCAontheactivityofnormalhepatytesandsteatosishepatocytes2.3HDCA对脂肪变性肝细胞FXR-PI3KAKT通路关键分子及PCNA和CyclinD1表达的影响为了进一步研究HDCA（300mol儿）抑制脂肪变性肝细胞活性的机制，通过WesternBIot检测发现，M+HDCA组中FXR雷白的表达高于M组（t=4.492,尸<0.05）（图4）。qRT-PCR检测M组和M+HDCA组的FXR、PCNAxCyclinDl以及PI3KAKT通路关键分子mRNA的表达变化，结果显示，相比于M组，M+HDCA组中FXRmRNA表达升高，PCNAnCyclinD1、PI3K和AKTmRNA表达均明显下降（P值均<0.05）（表2）。2.4FXR低表达肝细胞株的构建及HDCA对脂肪变性肝细胞FXRmRNA表达的影响为了验证HDCA（300molL）是否通过FXR抑制脂肪变性肝细胞活性，选择干扰FXR骄，在3条FXRsiRNA（FXRsiRNA1、2、3）扰效果最强的干扰链。结果如图5a所示,相比于M组，M+FXRsiRNA3的（P<0.01）qRT-PCR检测FXRSiRNA3干扰链对HDCA刺激脂肪变性肝细胞FXRmRNA表达妍扰效果，结期示，相比于M+HDCA组,M+FXRsiRNA3+HDCA组的FXRmRNA表达水平B胭降（氐（尸<0.05）（图5b）。2.5低表达FXR脂肪变性肝细胞中FXR-PI3K/AKT通路关键分子及PCNA和CyCIinD1蛋白表达的变化应用WesternBlOt检测FXR.PCNA.CyclinDtPI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达水平。结果显示，相比于M+HDCA组，M+FXRsiRNA3+HDCA组中FXR蛋白趣襁，PCN人PI3K、p-PI3KxAKT和>AKT蛋白趣增加，差异均有统计学意义（户值均<005）（图6）。愫*妁郴底HXU.OQJUU-M M*HDCA注：a,FXR蛋白印迹图；b,FXR蛋白相对表达应图4HDCA对脂肪变性肝细胞FXR表达的影响Figure 4 EffectofHDCAontheexpressionofFXRinSteatotichepatocytes注：a,3条FXRsiRNA干扰链对脂肪变性肝细胞中FXRmRNA表达的；b,FXRSiRNA3对HDCA束U统钠麒.图5FXRSiRNA干扰效果及HDCA对脂肪变性肝细胞FXR表达的影响Figure 5 EffectofFXRsiRNAinterferenceandtheeffectofHDCAonFXRexpressioninlipid-denaturedhepatocytes3讨论MAFLD发展包括单纯脂肪肝（以往称非酒精性脂肪肝）、脂肪性肝炎（以往称也旨肪性肝炎）、月醐性肝纤维化、肝硬化及肝癌等阶段（8）.MAFLD一旦进入脂肪性肝炎阶段，肝细胞脂毒性损伤以及炎症因子的大量浸润，会加快肝纤维化、肝硬化和肝癌的进展速度Ik。L因此脂肪性肝炎阶段早期防治尤为重要。胆汁酸是由肝脏合成的双性分子。在肝细胞胞质和微粒体中，胆固醇通过经典和替代两种途径生成初级胆汁酸111L初级胆汁酸分泌进入肠道后，在肠内细菌的作用下，转化为次级胆汁酸。HDCA是一种次级胆汁酸，存在于猪、鼠和人的胆汁中，在猪和鼠的胆汁中含量较高ML其对动物机（体的脂质代谢有着重要的调控作用I。Sehayek等国】发现在野生型C57BU6小鼠中，饲喂HDCA可以减少饮食中胆固醇从肠道吸收，对治疗小鼠血浆胆固醇升高和动脉粥样硬化有较好的效果Shih等【研究显示，饲粮中添加1.25%的HDCA可通过改善高密度脂蛋白功能来抑制低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠动脉粥样硬化的形成。目前，HDCA对MAFLD发生发展的影响未见文献报道.本研究发现浓度低于200molL的HDCA对正常肝细胞及脂肪变性肝细胞活性无明显影响，300molL及以上浓度的HDCA处理的L02肝细胞和L02脂肪变性肝细胞活性明显下降，同时PCNA、CyclinD1的mRNA表达降低，表明较高浓度的HDCA对脂肪变性肝细胞增殖活性具有抑制作用。FXR由FOIman等师于1995年在大鼠中发现。FXR是胆汁酸代谢的重要受体，通过调节胆汁酸在肝脏和肠道的合成、结合、摄取和转运以维持胆汁酸的动态平衡。疏水性胆汁酸鹅去氧胆酸对FXR的激活作用最强山】其次是脱氧胆酸和石胆酸，而亲水性胆汁酸熊去氧胆酸是最弱的FXR激动剂【。GW4064.奥贝胆豌FeXaramine等人工合成的FXR激动剂对FXR的激活作用更强f19-20j牛磺-B-鼠胆酸和甘氨熊脱氧胆酸是FXR的拮抗剂1”22L本研究发现300molL的HDCA处理24h后，脂肪变性肝细胞FXR蛋白表达明显增加，提示HDCA对FXR具有激活作用，能够上调肝细胞FXR的表达。FXR在各种代谢过程中发挥调节作用,包括脂肪代谢、胆汁酸平衡、葡萄糖平衡和细胞活性123.在肝脏中，FXR通过激活FXR信号通路，促进脂肪酸的氧化和胆汁酸的合成，减少脂肪酸的合成和蓄积，改善肝脂肪代谢异常LLFXR还与肝细胞的生长、凋亡以及炎症等生物学过程密切相关【绛27。此外，FXR通过调节肠道菌群的组成和代谢产物的生成，参与肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生和发展128291oFXR发挥各种代谢调节作用与PI3K/AKT信号通路有关。XU等1研究发现激活FXR活性，能够抑制P3KAKT信号通路的活化，降彳闻旨肪分解，增加脂肪生成，进而增加鱼体内的脂质积累。本研究结果显示，干扰FXR表达后，脂肪变性肝细胞PI3KAKT信号通路关键分子,如P3Kxp-PI3KxAKT和p-AKT的蛋白表达明显增加，提示FXR对PI3KAKT信号通路关键分子表达具有抑制作用；同时还发现，干扰脂肪变性肝细胞FXR表达后,反映细胞增殖活性的PCNA蛋白表达增加，提示FXR对脂肪变性肝细胞增殖具有抑制作用。以上结果表明HDCA通过上调FXR表达抑制PI3KAKT信号通路,从而造成脂肪变性肝细胞活性下降。FXRl>CNACyclinDlPI3Kp-W3KAKT， O S.O， 2.z1 .Lo.*S*R5C JP-AKTGAPDH畀备修ftw<NJd3 2 1H-长EXEftcQ.01 p<o.o fiLflI力OQl p<o.o jLlw-wi!J*B兴AP<0.05- 05 p<o.osS注：a,FXRPCNACycinD1、PI3Kp-Pt3KAKT和PAKT的蛋白E睡图；b,FXR蛋白的幽族达水平;C,PCNA蛋白的瞰俵达水平；d,CycinD1蛋白的相对表达水平；e,PI3K蛋白的相对表达水平；f,p-PI3K蛋白的相对表达水平；g,AKT蛋白的相对表达水平；h,P-AKT蛋白的相对表达水平。图6抑制FXR表达后脂肪变性肝细胞FXR-PI3K/AKT通路关键分子及PCNA和CyclinDl蛋白表达的变化Figure 6 ChangesintheexpressionofkeymoleculesofFXR-PI3KAKTpathwayandPCNAandCyclinD1proteinsinsteatosishepatocytesafterinhibitionofFXRexpression利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。作者贡献声明：汪远远负责实验设计和实施，撰写论文；邹艳负责数据收集与分析；刘朝霞负责图表制作；阳学风指导撰写文章并最后定稿。参考文献：1 ESLAMM.SANYALAJ.GEORGEJ.MAFLDAconsensus-drivenproposednomenclatureforMtabolicassociatedfattyIiverdiseaseJ.Gastroenterology.2020.15S(7):1999-2014D010.1053j.gastro.2019.11.312.2 COBBINAE.AKHLAGHIF.Non-alcoholicfattyliverdisease(NAFLD)-pathogenesis,classification,andeffectondrugmetabolizingenzymesandtransportersJ.DrugMetabRev.2017.49(2)：197-211.DOI.10.1080/03602532.2017.1293683.3 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