细胞凋亡(Apoptosis)研究进展.ppt

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1、细胞凋亡(Apoptosis)研究进展,问题的提出：细胞凋亡是一种普遍存在的生物学过程 它与细胞增殖、细胞分化都是最重要的生命现象，正是由于细胞增殖、细胞分化、细胞调亡的相互联系、相互制约的关系，才保证了生物体的正常发育。细胞凋亡在多细胞生物的生长发育以及维持正常的体内协调和平衡中起着十分重要的作用 正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞凋亡，都会使有机体出现病症，因此，对细胞凋亡的研究有助于某些疾病的阐明与治疗。细胞凋亡的研究是近年来生命科学中发展起来的热点课题。,Hayflick界限(Hayflick Limitation）,概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的

2、二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的 寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就 是 Hayflick界限 癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态 已经不同于原先的细胞 细胞的增殖能力与供体年龄有关 物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系二倍体细胞的凋亡是由细胞本身决定的 决定细胞凋亡的因素在细胞内部，而不是外部的环境 是细胞核而不是细胞质决定了细胞凋亡,不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数,细胞最高分裂次数,龟 90125人 4060 鸡 1535小鼠 1428,蝌蚪尾的消失,脊椎动物的神经系统的发育,发育过程中手和足的成形过程,细胞凋亡(Apoptosis)研

3、究进展,概述细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡的形态学和生物化学特征细胞凋亡的分子调控机理细胞凋亡与疾病及其治疗,现代生命科学的发展动态,细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学)相互渗透与交融是总的发展趋势,概 述,生命科学的研究从宏观上可以分为三个层次：核心层次（包括分子生物学和细胞生物学学科）、个体生物学层次（对多个物种及种群的结构及功能研究）、生物圈层次。无论是对细胞结构和功能的深入研究，还是对细胞重大生命活动规律的探索，都需要用分子生物学的新概念与新方法，在分子水平上进行研究，换句话说，细胞分子生物学或分子细胞生物学将是今后相当一段时间的主流。,（细胞凋亡研究所处的地位）,

4、对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,细胞生命活动,突变体分析,突变体分析,蛋白修饰分析,基因表达,多肽定性分析,生物信息学,序列测定,双向电泳分析,DNA分离与克隆,机器人技术(robotics),功能基因组学,蛋白质分离与制备,蛋白质组学,重点研究领域,染色体DNA与蛋白质相互作用关系 主要是非组蛋白对基因组的作用 细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控 细胞增殖、分化、凋亡与衰老是细胞最重要的生命活动现象，它们既相互联系又相互制约并受到一系列基因的调控。一切动植物的生长发育都是依靠细胞增殖、分化与凋亡来实现的。细胞信号转导的研究 包括细胞间信号传递、受体与信号跨膜传导、细胞内信

5、号传递途径 细胞结构体系的组装 生物大分子如何逐级装配并最终形成生物赖以进行生命活动的细胞结构体系的问题,美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI（Science Citation Index）收录及引用论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是：细胞信号转导（signal transduction）；细胞凋亡（cell apoptosis）；基因组与后基因组学研究（genome and post-genomic analysis）。,美国国立卫生研究院（NIH）在1988年底发表的一份题为什麽是当今科研领域的热门话题？（“What is popular in resea

6、rch today？”）的调查报告中指出，目前全球研究最热门的是三种疾病：癌症（cancer）心血管病（cardiovascular diseases）爱滋病和肝炎等传染病（infectious diseases：AIDS，hepatitis）五大研究方向：细胞周期调控（cell cycle control）；细胞凋亡（cell apoptosis）；细胞衰老（cellular senescence）；信号转导（signal transduction）；DNA的损伤与修复（DNA damage and repair）,细胞凋亡现象最早是1965年Kerr在大鼠肝细胞中发现的，当时他称这种现象为

7、“皱缩型坏死”。1972年，Kerr,Wylle和Curry在许多正常组织中观察到一种与经典的细胞坏死形态特征不同的现象：细胞收缩、细胞碎片、散在不完整细胞等，据此，他们首次提出apoptosis一词。国内常译为细胞凋亡、细胞凋落、细胞凋谢、细胞衰亡等，多数学者倾向于细胞凋亡。强调这一过程是一种自然的生理学过程。近10年来对细胞凋亡的研究日渐重视，现代研究结果表明：细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础，而且对胚胎发育、造血、免疫、乃至肿瘤都有极为重要的作用。,细胞凋亡的提出,细胞凋亡研究的模式生物,Caenorhabditis elegans,Drosophila melanogaster,A

8、rabidopsis thaliana,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，受到严格的由遗传机制决定的程序性控制，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmed cell death,PCD）。生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的 保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用（）：,1 有利于清除多余细胞 胚胎发育的某个阶段，特定区域的多余细胞发生凋 亡，利于器官的形态形成。如指和趾的形成。,2 有利于清除无用细胞 形态发生时，一些遗迹随发育而凋亡。如人胚的 尾芽和鳃的定期消亡、蝌蚪退尾、人体性别

9、的分化。,3 有利于清除发育不正常的细胞,4 有利于清除有害细胞 作为自身的一种保护机制,5 有利于清除完成正常使命的衰老细胞 如人红细胞、动物表皮细 胞、胃肠道细胞,6 维持器官、组织细胞数目相对平衡 细胞凋亡和细胞增殖是一个相 反的过程，细胞增殖低下和/或凋亡过盛，引起器官萎缩，肿瘤发生既 与细胞增殖过度有关，又与细胞凋亡不足有关。（）,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,细胞凋亡与坏死(necrosis)细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡的生化特征诱导细胞凋亡的因子细胞凋亡的检测,细胞凋亡与坏死(necrosis),二者的主要区别 细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然

10、后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应（）,细胞凋亡 是细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀，是由凋亡相关基因调节控制的，故亦称编程性细胞死亡。,细胞坏死 指各种致病因子干扰和中断了细胞正常代谢活动而造成的细胞意外死亡。,细胞凋亡与细胞坏死的主要区别,特征 细胞凋亡 细胞坏死,细胞核 染色质边缘化 核浓缩 核凝集断裂 核破碎 凋亡小

11、体 核溶解 细胞质 浓缩、胞质气泡 显著膨胀 细胞器结构保留 细胞器破坏 细胞膜 完整 破裂 DNA电泳 阶梯状条带 弥散分布条带 合成代谢 新RNA蛋白质合成 合成代谢终止 炎症反应 无 有 基因调节 由凋亡相关基因调控 与基因调控无关 发生条件 多为生理性 只为病理性（）,细胞凋亡的形态学特征,凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某 些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞

12、质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化（）,细胞凋亡的发生过程，在形态学上可分为三个阶段：,在光镜下表现为：细胞凝缩，染色质致密、边缘化、核凝集，染色体断裂形成核碎片。细胞质气泡化，凋亡小体形成并从胞体脱落，被周边细胞吞噬。,在电镜下表现为：细胞核：早期缩小，电子密度增高，核膜皱缩，染色体密集于核膜下，分布不均匀；中期核高度凝集致密化；晚期核膜消失，染色体断裂，核被分裂成碎片。核碎片在细胞质中与细胞器等成分一起被细胞膜包裹成圆形的凋亡小体。细胞质：密度增高，细胞骨架被破坏；内质网扩大为泡状。细胞膜：微绒毛丧失，但膜完整性始终保持

13、。（）,细胞凋亡的生化特征,凋亡细胞的组织转谷氨酰胺酶（tissue Transglutaminase，tTG）积累并达到较高水平,细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180 200bp特征性的DNA ladders,将凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可以发现其DNA片段呈间隔180200bp的阶梯状电泳条带，而未凋亡的DNA无降解，电泳条带表现为一大分子片段,tTG是依赖于钙离子的酶，在正常细胞中，由于Ca+浓度较低，tTG的活性较低，当凋亡起始时，Ca+浓度上升，从而使tTG活化。其作用是保持凋亡小体的完整性，防止有害物质的逸出。,诱导细胞凋亡的因子,物理性因子，包括射线（紫外线，射

14、线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子（TNF）等,细胞凋亡的检测,形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段呈现出梯状条带DNA断裂的原位末端标记法（TUNEL测定法）：凋亡细胞DNA降解产生缺口和末端，故可用原位缺口翻译或末端标记法显示凋亡细胞。彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细 胞，同时又能观察细胞的周期状态。,对细胞凋亡的检测是基于凋亡细胞的形态学和生

15、物化学特征,1 ced基因 在一种无脊椎动物线虫中发现的一组基因，共14个，其中ced-3,ced-4,ced-9研究的较为清楚。Ced-3编码530个氨基酸，其中有100个氨基酸为丝氨酸富含区。2 ICE基因 是哺乳动物中克隆出的ced-3的同源基因，为白细胞介素1转化酶（inter-leukin-1 converting enzyme）。是一种底物特异性半胱氨酸蛋白酶（cystein aspartic acic specific protease,caspase家族)，这个家族的共同点是特异的断开天冬氨酸后的肽键.3 bcl-2 从人的滤泡性B细胞淋巴瘤中分离出的与ced-9同源的抑制细胞

16、凋亡的一组基因，位于人第9号染色体上。4 rpr基因 从果蝇中分离出的诱导细胞凋亡的基因，有65个氨基酸组成。5 c-myc基因 是一多功能的原癌基因，存在于核仁中，可抑制凋亡。6 p53基因 肿瘤抑制基因，促进细胞凋亡可能是肿瘤生长抑制的主要原因。另外Fas/APO-1,ras,TNF,TGF-1,RP-2,RP-8,PD-1都是已报道的与细胞凋亡有关的基因。,目前发现的调控细胞凋亡的相关基因,三、细胞凋亡的分子调控机理,线虫(C.elegans)是研究细胞凋亡的理想材料，可以直接观察不同发育时期某些细胞群的定期死亡，现以发现10几种与细胞凋亡有关的基因。研究发现ced3,ced4基因促进细

17、胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。（）Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1Caspase家族与凋亡Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡,（）线虫细胞凋亡的研究 线虫（C.elegans)是研究细胞凋亡的理想材料，提供了一个良好的模型。它虫体透明，易于观察。早期研究发现虫体在不同发育时期某些细胞定期死亡。在整个发育过程中，有131个细胞陆续进入死亡程序，决定这些细胞进入死亡程序的是一系列凋亡基因。现已从中分离出10余个凋亡基因。,正常细胞 走向死亡细胞 死细胞 降解细胞,起动死亡程序,执行死亡

18、程序,被吞噬处理,Ced-2,Ces-1cgl-1,Ced-9ced-3 4,Ced-125ced-567ced-810,nec-1,其中研究的较清楚的是ced-9(抑制细胞凋亡）、ced-3,ced-4(促进细胞凋亡）（）,线虫细胞凋亡的过程可划分为四个阶段：1 命令阶段（execution）这一阶段决定细胞凋亡与否，通过基因ced-3和ced-4的指令可以执行细胞凋亡，使细胞有程序有步骤的凋亡，而ced-9基因则能阻止这一凋亡过程的执行。2 细胞凋亡阶段（death）已经接受凋亡指令的细胞，在这一阶段将受ced-3和ced-4基因的调控而停止生长，选择凋亡途径。3 细胞吞噬阶段（engul

19、fment）这一阶段细胞处于被临近细胞吞噬的状态。控制这一过程的基因有两组：即ced-1,ced-6,ced-7,ced-8基因组和ced-2,ced-10基因组。4 分解阶段（degradation）凋亡细胞被吞噬后很快分解，这一阶段起作用的基因是nec-1.(）,Caspase家族与凋亡,Caspase家族 在哺乳类找到的一组与ced-3基因同源的基因，构成一个家族，即Caspase家族。Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即CaspaseCas

20、pase活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径,Caspase活化,Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活则需在两个亚基的连接区的天冬氨酸位点进行切割（裂解活化），结果产生了由两个亚基组成的异二聚体，此即具有活性的酶。,胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径,凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase

21、结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。,Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡,Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3，这三个区域是调节凋亡所必需的结构。Bcl-2、线粒体与细胞凋亡,Bcl-2、线粒体与细胞凋亡,当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspa

22、se3，另 一方面使bcl-2裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成 复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活 化Procaspase9，最后引起细胞凋亡,a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜)c 凋亡细胞(透射电镜)(扫描电镜),caspase 超家族成员及其相应底物,BCL-2家族成员,细胞凋亡可能的调控机制通过对线虫、昆虫、鼠和人的细胞凋亡研究，发

23、现它们的凋亡相关基因有相当的保守性，它们在凋亡过程中起着相同的作用，这说明有共同的调控机制。不同信号、不同类型的细胞能产生似乎相同的细胞凋亡改变，提示细胞凋亡存在着共同的途径，也就是说各种信号通过复杂的传导将汇集到一点上，然后通过共同的最后通路导致细胞凋亡。研究表明：蛋白激酶C(PKC)可能是多种信号传导途径的汇集点，由它启动细胞生存或死亡的“开关”。,生长因子受体 PLC IP-2 DAG PKC,Ca离子 G蛋白磷酸化 细胞凋亡,TPA 转录因子磷酸化 细胞增殖,四、细胞凋亡与疾病及其治疗,细胞凋亡与人类疾病细胞凋亡不足及细胞凋亡过度都会造成疾病,与凋亡抑制有关的疾病 与凋亡升高有关的疾病

24、,1 肿瘤 1 AIDS,滤泡型淋巴瘤 2 神经变性疾病,激素依赖性肿瘤（乳瘤）巴金森氏病,2 自身免疫病 色素性视网膜炎,系统性红斑狼疮 3 再生障碍性贫血,免疫介导的肾小球炎 4 缺血性损伤,3 病毒感染 心肌梗死，中风,疱疹病毒，腺病毒 5 酒精中毒性肝病,针对疾病种类的不同，可以通过抑制或者增强细胞凋亡的措施治疗有关的疾病：,1 诱导细胞凋亡治疗因凋亡受抑而致的疾病放疗和化疗能激活肿瘤自杀程序，导致瘤细胞凋亡。,2 抑制细胞凋亡治疗因凋亡过量而致的疾病神经生长因子治疗神经系统退行性病变，可以延缓神经元凋亡。,改变细胞凋亡状态用于疾病治疗的许多措施尚属试用阶段。一个十分诱人的设想是基因治

25、疗通过载体导入凋亡相关基因干预细胞的凋亡调控来实现。,结 语,细胞凋亡与细胞增殖、细胞分化都是细胞最基本的生命活动；,细胞凋亡在多细胞生物体的生长发育以及维持正常的体内协调和平衡中起重要作用；,细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，受到严格的遗传机制程序化调控；,细胞凋亡的研究以线虫进展最快，其中对ced-3,ced-4,ced-9基因及其表达研究的最为深入。在哺乳类找到一组与ced-3基因同源的基因，构成一个家族，即Caspases,Casp家族。Bcl-2家族是ced-9在哺乳类中的同源物，与ced-9一样，能抑制细胞凋亡。,细胞凋亡不足或凋亡过度都会造成细胞乃至机体的疾病，

26、可根据细胞凋亡的调控机理有针对性的治疗某些疾病。,坏死细胞,凋亡细胞,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker（自赵允、翟中和）,综上所述，目前对细胞凋亡的研究已成为生命科学研究领域的热点课题。在相继发现某些凋亡基因的基础上，在凋亡机制的探讨方面也已做了大量的工作，有了一个比较清晰的了解，当然不少细节仍需进一步阐明。细胞凋亡与疾病关系的研究也取得了长足的进步，有理由相信，细胞凋亡的研究成果，不仅揭示胚胎发育的调控机理，而且将为人类某些疾病的治疗和控制提供有效的途径。,