抗原的提取与制备.ppt.ppt

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1、绪言,第一节 免疫学技术的范畴与应用,一、免疫学技术的范畴二、免疫学技术的应用特点,免疫学技术的范畴,1、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定2、对具有免疫活性物质的定性、定量测定（范围较广）,免疫学技术的应用特点,1、对象“包罗万象”2、方法“兼容并蓄”（牵涉到物理，化学，生物，医学，计算机等各学科）,*如何学习和使用免疫学技术？基本原理的理解+说明书和手册（向仪器或试剂盒供应商索取或网上下载）,第二节 有关免疫学基本概念,一、抗原的概念与属性二、免疫细胞的概念与分类三、免疫应答的概念与过程,1、与抗体结合的物质2、能够被免疫系统识别的物质3、能够激活免疫细胞并与免疫效应物起反应的物质,抗

2、原,免疫原性可识别、可反应性（诱导机体产生免疫应答的特性）免疫反应性 选择结合性（和免疫应答产物特异性结合的特性）,抗原的概念与属性,*抗原和半抗原,免疫细胞的概念与分类,免疫细胞（Immune cells）泛指所有参与免疫应答及与免疫应答活动相关的细胞。免疫活性细胞（Immune competent cell，ICC）能够接受抗原刺激、产生特异性的活化、增殖、分化并形成效应产物的淋巴细胞。,免疫细胞的类型,红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞,免疫应答的概念与过程,免疫应答（immune response）免疫系统接触抗原后，免疫细胞对抗原进行

3、识别；并使特异性淋巴细胞活化、增殖；表现出免疫效应的过程。免疫应答的阶段1、抗原识别阶段（antigen-recognizing phase）2、淋巴细胞活化阶段（lymphocyte-activating phase）3、抗原清除阶段（antigen-eliminating phase）,第三节 抗原抗体反应的基本原理,一、抗原抗体反应的原理二、抗原抗体反应的特点三、影响抗原抗体反应的因素,抗原抗体反应的原理,1、抗原抗体之间的作用力2、抗原抗体结合物析出原因,参与抗原抗体相互作用的力,1、电荷引力（库仑引力）2、分子力（Van der Waals力，分子随机产生的电偶极矩极化而引起的相互作

4、用）3、氢键结合力（氢和电负性大的原子结合,带正电的原子核暴露于外,可吸引其它电负性大的原子）4、疏水作用力（由大分子中疏水基团相互接近.而形成的一种作用力）,*以上作用力均非共价键,单独的抗原或抗体不自行聚合析出的原因,亲水胶体的形成1、电荷排斥力（由蛋白质的等电点决定）2、水化层的形成,抗原抗体的析出,抗原抗体的结合：可以导致电荷的中和水化层破坏 蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体，聚合析出,需要电解质的辅助,抗原抗体反应的特点,1、特异性2、可逆性3、适合比例性,特异性及其相对性,抗原A,抗原C,抗原B,特异性反应,交叉反应,无反应,抗体,可逆性,K（亲和常数）=,Ag+Ab,Ag Ab,适

5、合比例性,抗体含量,抗原含量,前带,后带,等价带,网格学说（lattice theory）,抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,抗原抗体反应的影响因素,1、电解质2、酸碱度（pH值6-8）3、温度（37-42。C）,第四节 免疫学检测技术的评价,一、评价标准 二、特异性与敏感性的关系,评价标准,Specificity（特异）：检测信号针对性和排它性Sensitivity（灵敏）：可测出的最低含量Simplicity（简便）：操作是否方便Safety（安全）：是否有污染，对操作者的伤害Saving（节约）：性能/价格比,特异性与敏感性的关系,灵敏度高、特异性低（假阳性）特异性高、灵敏度低（假阴

6、性）,抗原的提取与制备,第一节 抗原/免疫原制备的基本概念,一、抗原制备的目的二、抗原的“纯度”三、抗原制备的主要技术途径,抗原制备的目的,免疫原：激活T、B细胞半抗原：检测相应抗体,抗原的“纯度”,免疫原：除保留可被B细胞识别的抗原决定簇，还需保留足够的被T细胞识别的抗原决定簇半抗原：尽可能减少影响反应特异性的抗原决定簇,抗原制备的主要技术途径,天然抗原分离、纯化半抗原人工合成、载体联接抗原肽 合成、基因工程制备,第二节 完全抗原/免疫原的制备方法,一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备,颗粒性抗原的制备,1、抗原的获取：采集分离2、无害化处理：去除对机体有毒成分，如用甲醛,（细胞，细菌）

7、,可溶性抗原的制备与纯化,1、处理与粉碎2、蛋白质分离富集3、单一组分提取4、抗原纯度鉴定,（蛋白质、糖蛋白、脂蛋白）,处理与粉碎,组织粉碎：机械 高速捣碎机，研磨 生物 酶消化（蛋白酶、胶原酶）细胞破碎：物理 反复冻融，冷热交替，超声 化学 表面活性剂 生物 溶酶，自溶,蛋白质分离,选择性沉淀：盐析，有机溶剂沉淀，水溶性非离子型聚合物沉淀（聚乙二醇）透析技术：半透膜超滤技术：负压+滤膜,单一组分提取的方法,层析技术：凝胶过滤 离子交换 亲和层析,凝胶层析（分子筛）,离子交换层析,亲和层析,单一组分提取的方法（续）,离心技术：差速离心 密度梯度离心电泳技术：电泳洗脱 等电聚焦,密度梯度离心法控

8、制溶液的比重，将不同比重的分子或细胞通过离心方法加以分离分为：*不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法）*连续密度梯度离心法,不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法）分离液仅形成单一的密度层，可在该层中获取与其比重一致的细胞或分子。该法较多用于外周血单个核细胞的分离，常用的分离液为Ficoll。,聚蔗糖泛影葡胺,不连续密度梯度离心分离法,连续密度梯度离心法分离液可形成一连续的密度梯度层，在不同的密度梯度层中可获取所需的不同种类的细胞。该法可一次分离得到几种所需的不同类型血细胞。常用于外周血细胞的分离，使用的分离液为Percoll。,聚乙烯吡咯烷酮,连续密度梯度离心分离法,单一组分提取的方法

9、,电泳技术：电泳洗脱：根据蛋白质的电荷和分子大小分离等电聚焦：根据蛋白质的等电点分离,电泳技术(等电聚焦),抗原纯度鉴定,方法：电泳法 免疫法 层析法指标：电泳纯（电泳法）免疫纯（免疫扩散法，纯度要求高）,第三节 半抗原免疫原制备的方法,一、载体的选择二、半抗原与载体的联接,载体的选择 结构复杂的大分子,蛋白质载体：BSA、HSA、OVA（卵清蛋白）、KLH（钥孔嘁血蓝蛋白）聚合多肽载体：多聚赖氨酸高分子聚合物载体：羧甲基纤维素,半抗原与载体的联接,1、连接方式：物理法（吸附）化学法2、化学连接方法：直接联接法：适用于带游离氨基或游离羧基的半抗原 间接联接法：适用于没有游离氨基或游离羧基的半抗

10、原,半抗原与载体直接联接,碳化二亚胺法蛋白质-COO+R-N+=CN-R H-N+-R蛋白质-COO-C-NH-R+半抗原-NH2 O蛋白质-C-NH-半抗原+R-NH-CO-NH R,半抗原与载体直接联接,戊二醛法蛋白质-NH2+半抗原-NH2+COH-（CH2）3-COH蛋白质-N=CH-（CH2）3 CH=N-半抗原,半抗原与载体直接联接,氯甲酸异丁酯法半抗原-COOH+Cl-COO-CH2 CH（CH3）2 O O半抗原-C-O-C-O-CH2CH（CH3）2+蛋白质-NH2 半抗原-CO-NH-蛋白质+HO-CH2CH（CH3）2,半抗原与载体间接联接,琥珀酸酐法 O O半抗原-CH

11、2 OH+C-O-C CH3 CH3 O半抗原-CH2 O-C-(CH2)2-COOH,半抗原与载体间接联接,O-（羟甲基）羟胺法半抗原-C=O+H2 N-O-CH2-COOH 半抗原-C=N-O-CH2-COOH,半抗原与载体间接联接,一氯醋酸钠法半抗原-OH+Cl-CH2-COONa半抗原-CH2-COOH,半抗原与载体间接联接,重氮化的对氨基苯甲酸法HOOC-NH2+NaNO2 HOOC-N=N半抗原-OH+HOOC-N=N半抗原-N=N-COOH OH,本章小结,1、免疫学技术的应用范畴2、免疫学的基本概念3、抗原抗体反应的原理、特点、影响因素4、抗原制备的方法,思考题,1、免疫学技术的应用范畴有哪些？2、体外抗原抗体反应有哪些特点？3、可溶性抗原的制备涉及哪些技术？4、如何使半抗原具有免疫原性？举例说明 半抗原与载体的联接方法。,