生物制药细胞工程单克隆抗体.ppt

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1、Emil von Behring,1901,antitoxins,Georeges Kohler and Cesar Milstein,1984,monoclonal antibody,Susumu Tonegama,1987,structure of Ig gene,Gerald Edelman and Rodney Porter,1972,structure of antibody,Paul Ehrlich,1908,production of antibody,Nobel Prize winners,发明单克隆抗体技术Nobel Prize in 1984,抗体发展的三个阶段,单克隆抗体

2、,基因工程抗体,多克隆抗血清,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴結,B 細胞,细胞工程杂交瘤技术,鼠单抗,人单抗,大鼠,小鼠,产量高、操作比小鼠麻烦 少用,易操作、多用,HAMA反应,人人杂交瘤,人B细胞、骨髓瘤细胞融合,人鼠杂交瘤,人B细胞、鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤制备人单抗的问题：染色体易丢失、抗体分泌不稳定,美国已上市16种单克隆抗体药物 2002年销售额 29亿美元 2005年 90亿美元 我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段。,2002年完全人源化单抗humira获得批准上市，这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义大事，预示着单克隆抗体药物一个迅猛

3、发展的新时代的来临。Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物。,Avastin 是美国刚刚上市的治疗结肠癌的抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选出的 Fab 段抗体药物。Avastin的上市使公司的股价上升了90亿美元。,抗血小板凝集的原理图,抗体药物销售趋势图,全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体 正在进行临床试验的抗体公司（38家）：,AbgenixAlexion PharmAltarexApplied Molecular EvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT(Cambridge A

4、b Tech)CelltechCenteonCentocor(Johnson&Johnson),ElanElsaiEli LillyGenzyme TransgenicsGenentechGenmabHoffman-La RocheICOS PharmIDEC Pharm/MitsubishiImClone SysImmunotechKaneboKnoll Pharm,LeukoSiteMedarexMedimmuneNorvartisOrtho BiotechPasteur-MerieuxProgenicsProtein Design LabScheringSmithKline Beecha

5、mTanox BiosystemsTechnicloneXomaZenyaku,Monoclonal Antibodies on the Market,Monoclonal Antibodies on the Market,抗体 是对其抗原有极强专一性 的魔弹 或 巡弋飞弹,研 究以免疫转印法检测 特定抗原医 疗以毒素连结抗体攻击 病变細胞检 验以 ELISA 侦测特定 病原体,SDA批准进入临床的体内诊断用抗体,131I-抗人肝癌单克隆抗体(HAb18、Hepama-1）99mTc-抗人小细胞肺癌单克隆抗体（2F7）,SDA批准进入临床的治疗用单抗,抗T细胞免疫毒素抗C-ALL免疫毒素131

6、I-抗肝癌单克隆抗体抗人CD25单克隆抗体抗乙脑单克隆抗体抗流行性出血热抗体抗人CD3单克隆抗体抗人IL-8单克隆抗体,抗体治疗疾病的机制,抗原失活免疫效应细胞吞噬抗原表面弱化易受补体破坏,单抗研发的演变历程,鼠单抗100%鼠源OKT-3PanorexZevalin,鼠/人嵌合单抗(66-75%人源)ReoPro,RituxanRemicadeSimulect,人源化单抗(90-95%人源)Zenapax,Mylotarg,Herceptin,CampathSynagis,100%人源,抗体攻击病毒,凝集细菌,抗 SARS 的单抗,SARS-CoV,抗体生成技术,Epitope,Antigen

7、ic determinant,抗原決定基,一个抗原分子上可能有数个抗原決定基,每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体,蛋白质性 抗原決定基 含有六个以上氨基酸,整体水平抗体生成技术,细胞工程抗体生成技术,基因工程抗体生成技术,多克隆抗体（抗血清）,单克隆抗体,嵌合抗体、改形抗体,“小型化抗体”（单链抗体）,组合抗体库技术,噬菌体抗体库技术,Ig基因转基因小鼠,抗体真核表达技术,1 多克隆抗血清,对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（a）和免疫后10天（b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g 球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺

8、失（c）。,a1,a2,b,g,白蛋白,球蛋白,（c）,（a）,（b）,来源:组织和细胞，其成分比较复杂。1.组织和细胞成分混合抗原制备 2.蛋白质抗原制备 3.核酸抗原制备 4.类脂多糖抗原制备 5.免疫球蛋白片段制备 6.纯化抗原的鉴定,二、可溶性抗原制备及鉴定,可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸,可溶性抗原制备及鉴定,返回,组织和细胞成分混合抗原制备程序,上清液澄清,所用材料必须是新鲜或低温保存的,去除包膜或结缔组织,脏器进行灌洗,洗去血迹及污物,NS内含0.5gL NaN2,冷浴中组织剪碎,装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液,3000rmin10

9、min,取上清液,去除细胞碎片及微小组织,离心,绵羊红细胞的制备流程图,摇动15-20min,4,可保存3周,取适量,NS洗涤3次2000r/min 10min,NS稀释至 25%,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养 3724h,100水浴 22.5h 杀菌,无菌试验,NS稀释成810亿/ml,O菌体抗原,返回,杂交瘤技术过程,多克隆抗体,多克隆抗体（polyclonal antibody）指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风，胎盘球蛋白 抗病毒感

10、染等 副作用：超敏反应（2）临床诊断，如：肥达氏反应-伤寒、副伤寒 缺点：特异性差。,多价抗原,单克隆（致敏的B细胞）,单克隆抗体,单克隆抗体,传统抗血清的交叉反应,专一性反应,沒有反應,交叉反应,+,-,?,1 2 3 Ag A,x y z Ag B,1 2 0 Ag A,可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。,癌细胞可培养生长,浆细胞B cell可分泌抗体,融合瘤Hybridoma,细胞融合,两组染色体混在一起,也可以培养生長产生专一性抗体,一個 B cell 只产生一种抗体,一个 B 细胞只能生产一种抗体，对付某一 抗原決定基。,若有许多抗原決定基，则

11、需许多株 B 細胞分別生产许多抗体。,B,B,B,Y,Y,Y,Y,抗 原,B,Y,B,亲和力成熟,1,1,2,3,4,抗原決定基,1,2,3,4,1,2,3,4,单抗,细胞融合,取出脾細胞,+癌細胞,各抗体分开,1,2,3,4,m,核酸补救合成,m,核酸从头合成,核酸,氨甲喋呤(A),(-),次黄嘌呤(H)胸苷(T),TK,HGPRT,TK-,HGPRT-,抗体,-a,-b,-c,-d,-a-b-c-d,BALB/c,a,b,b,c,d,传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和,脾脏产生各种 B 細胞,免疫前要先把抗原作成乳剂,免疫,抗原,采血后可得传统抗血清,已建立之小鼠骨髓癌细胞株,由脾脏收集

12、B 細胞,抗原通常有多个抗原決定基,免疫后的脾脏,约在两月內注射五到八次,Ag X,细胞融合,AgX,AgX,ELISA,HAT,PEG Cell fusion,Hybridoma cells 融合瘤细胞,（Subcloning）(确定只有一种细胞),d,d,abcd,abcd,+,+-,X,-d,-c,-b,-a,+,-,-d,分株培养筛选,筛选,单抗,传统抗体(抗血清),试验专一性,对抗原的反应,无法分辨,完全不同,抗体的结构,1 小分子抗体,3 鼠单抗人源化,基因工程改造的抗体,2,(1)小分子抗体,1,2,3,小分子抗体,Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段Sd

13、Ab：单区抗体,免疫球蛋白基因载体的构建,H链表达载体,L链表达载体,共转染细胞,Pr VH CH1 Pr VL CL,图5 Fab 抗体分子的制备,I Fab antibody molecule,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,图5 Fab 抗体分子的制备,II Fv antibody molecule,双特异性抗体,抗原A,抗原B,-S-S-,Fab,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,VH,VL,Fv,VH,VL,许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结

14、在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。,CTL,CD3,TUMORCELL,-S-S-,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,抗原A,抗原B,(2)抗体融合蛋白,抗原结合部位与生物活性蛋白结合含Fc段的抗体融合蛋白免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、延长血清中半寿期 生物学效应功能,G-CSF,Fc,Fusion Protein,DNA ligation,expression,Fc的作用：延长血清中半寿期,(3)鼠单抗人源化,将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体恒定区人源化人-鼠嵌合抗体可变区人源化人

15、改型抗体用抗体库技术进行人源化,鼠单抗人源化,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,免疫球蛋白基因载体的构建,H链嵌合载体,L 链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,鼠VH,鼠VL,人CL,人CH,抗体分泌细胞,人-鼠嵌合基因工程抗体,定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗,人改型抗体（CDR移植）,人源化抗体又称CD

16、R移植抗体,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体,图4 鼠单克隆V区人源化（CDR移植）,抗体库技术,抗体库在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire),三 基因工程方法研制新的单抗,抗体库技术产生的三项技术基础,RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术（phage display),接头DNA,VH VL,图2 噬菌体表面呈现的小分子抗体,基因III或基因VIII,外壳蛋白,VH,VL,噬菌体抗体图示,定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌

17、体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性,噬菌体抗体库技术,用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人,（一）基本原理和程序,噬菌体抗体库,从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR

18、技术扩增不同的Ig基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。,构建噬菌体抗体库,模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和

19、力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体,（二）噬菌体抗体库技术的特点,抗体库的构建,抗体库的富集筛选,治疗性抗体的研发阶段,靶标发现抗体制备抗体筛选、确认和优化中试工艺研究临床前研究临床研究,主要研究进展,靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他,靶抗原的发现,TRAIL:TNF-related apoptosis-induced ligandTRAILR:DR4、DR5、DcR1、DcR2、OPG,Protein extraction and digestion,Treated/Sick,Control/

20、Healthy,Mass Spectrometer,Protein peptides,identification,MS spectra,quantification,characterization,P,O,Phosphorylation,Oxidation,post translational modifications(PTM),Peptides,and MS/MS spectra,HPLC,Proteomics,20a5-6 Heavy Chain,功能单抗识别表位可能是一个新的药靶？,主要研究进展,靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他,治疗性抗体

21、产生抗抗体的比例,抗体人源化的主要技术,嵌合抗体CDR移植,FR移植,SDR移植表面氨基酸残基人源化抗原表位定向选择,嵌合抗体、CDR移植抗体,SDR人源化方法,鼠抗体（红）和人源化抗体（绿）Fv结构的叠合图,表面氨基酸残基人源化,人源化抗体识别的抗原表位与親本抗体相同,抗原表位定向选择,H,L,人抗体重链文库,人源抗体制备技术,人人杂交瘤技术 EB病毒转化技术 人源抗体库 噬菌体抗体库 合成抗体库 核糖体展示抗体库 转基因动物,人源抗体的生产过程,大容量抗体库,合成抗体库,核糖体展示scFv文库,各种抗体库筛选方法,感染性筛选,抗原库对抗体库筛选方法,提高抗体特异性和亲和力,Chain sh

22、uffling,计算机模建技术,定点突变技术,chain shuffling 原理示意图,L,H,L,L,L,L,H,L,H,L,H,H,H,H,H,L,更高亲和力抗体,亲和筛选,建抗体库,亲和筛选,+,重链文库,建抗体库,轻链文库,高亲和力抗体,+,亲本抗体,抗体H22计算机分子设计与直接进化,S-B(10-11M),Ka 6x1010L/mol,B/F,抗体CH22m亲和常数测定,Items,Z12 Ka=8107M-1 1/750CH22 Ka=9109M-1 1/6.5mCH22 Ka=61010M-1 1Remicade Ka=11010M-1 1/6,Antibody affini

23、ty,移植人免疫球蛋白的小鼠,抗体结构信息具有重要的研究价值,Her2靶点人源抗体（HF)的设计与验证,HF人源抗体对Her2+细胞的ADCC杀伤效应分析,新抗体或抗体类似物的设计,以抗原抗体复合物的晶体结 构设计新抗体以人抗体Fc为支架设计类抗体以全人抗体为支架设计小抗体以非Ig的人蛋白为支架设计功能分子,PT4LinkerFC融合蛋白的构象,PT4-Linker-FC与TNF-相互作用复合物的构象,拮抗肽linkerFc融合蛋白设计,单域抗体（PTVH5）设计,PTVH5与TNF形成的复合物模型,单域抗体 单链抗体(scFv),单链抗体（TSA1、TSA2）设计,主要研究进展,靶抗原的发现

24、抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他,抗体药物的作用机理,直接效应 诱导凋亡 抑制增殖 阻断生长因子或生长因子受体 干扰血管生成间接效应 依赖补体的细胞毒（CDC）依赖抗体的细胞毒（ADCC)作为毒素、放射性同位素和细胞 毒药物的载体 形成抗独特型抗体 通过双特异性抗体靶向效应细胞,抗体偶联细胞毒物质,TUMORCELL,Fab,免疫毒素(植物和细菌)同位素(I131,I125,In111)抗体导向化学疗法（甲氨喋呤,长春新碱,阿霉素）裂解药物的酶,抗体偶联细胞毒物质,-S-S-,（链亲和素）,免疫毒素（白喉毒素 蓖麻毒素 相思豆毒素）,C,C,V,C,V,C,C,C

25、,SPDP,SPDP,Ricin A,Ricin A,（-FcRI-Ricin A）,抗体融合蛋白,抗体融合蛋白,抗人Her2/neu单抗-IL-2,CTLA-4-Ig,抗纤维蛋白-ProUK,抗活化血小板-UK,双功能抗体作用原理,BsAb,BsAb,效应细胞,靶细胞,触发受体,膜表面分子,NK细胞,CD16,肿瘤细胞,HER2/neu,抗HER2/neu抗CD16 BsAb,BsAb,双特异性抗体介导的杀伤作用机制（a),BsAb桥连效应细胞和靶细胞；(b),连接的触发分子启动细胞毒反应；(c),效应细胞对靶细胞产生致死性杀伤反应。,细胞毒反应,细胞内抗体：在细胞内合成并作用于细胞内组分的

26、抗体,细胞核,EGFR,EGFR,EGFR,目前细胞内抗体的研究主要集中在单链抗体上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信号（targeting signals），如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。,细胞内抗体,细胞内抗体的作用机理,阻断靶蛋白的活性部位阻断细胞内蛋白蛋白相互作用干扰细胞内靶蛋白的转运促使靶蛋白降解,细胞内抗体的应用：由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性，因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢。主要为：分子功能的研究下调生长因子受体的表达 抑制细胞内癌蛋白的活性 抑制病毒复制，如 抗HIV 外壳蛋白 gp120抑

27、制艾滋病毒复制,细胞内抗体广泛应用前存在的问题：基因转移系统的建立，特别是体内基因转移时基因的靶向传递的问题，使细胞内抗体基因导入充足数量的靶细胞中；细胞内抗体基因的持久表达及使细胞内抗体达到一定的浓度；细胞内抗体应无毒及不具免疫原性。鼠源性ScFv可引起人体发生细胞毒性T-细胞反应。应用人源性或人源化抗体可克服此问题。,抗体的ADCC和CDC效应,提高ADCC和CDC的策略,抗体Fc突变改变抗体糖基化,Rituximab Fc的三维结构,Rituximab突变体与C1q的结合,主要研究进展,靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他,提高表达量的方法,应用扩增

28、系统 GS/DHFR弱化选择标记基因应用有利于基因表达的元件 强启动子 强增强子 反式作用元件位置效应（position effects),Cre-LoxP定点整合系统,抗体的糖基化,主要研究进展,靶抗原的发现抗体人源化改造及人源抗体制备提高抗体效应功能提高抗体表达量其他,抗体可变区和框架区的影响 抗体稳定性 可溶性 折叠动力学 表达,PEG化的抗体或抗体片段,重组多克隆抗体,重组多克隆抗体,优点：可大量生产，批间稳定性好 结合抗原的亲合力高 识别多个抗原表位，对复杂靶抗原的 治疗效果好 对于易变的抗原也能有效,二、单克隆抗体的应用,1.医学检验试剂：传染病的快速诊断 寻找TSA及检测TAA

29、免疫细胞抗原检测 激素测定 血中药物浓度监测 HLA分型监测,二、单克隆抗体的应用,2.导向治疗作用3.抗原物质的分离和提纯,抗体靶向的酶前药治疗 ADEPT antibody directed enzyme rodrug therapy,抗体与酶分子偶联,Tumor cell,毒性药物,2、ADEPT体系的构成要素 抗体 选择有效靶抗原：肿瘤细胞表面表达，分泌进入肿瘤细胞间质，常出现在血浆中，竞争 以具有不同的抗原靶向性的多种抗体与相同酶构建 IgG1 IgG2 或F(ab)2 Fab ScFv重组的抗原结合蛋白,酶 不能用广泛存在于人体内的酶 如：细菌、植物来源 有免疫原性 3类酶：a 无

30、哺乳动物同源性的非哺乳动物来源 如羧肽酶、青霉素G（V）氨基化酶 避免内源性酶非特异性活化，可能诱发免疫反应,b 具哺乳动物同源性的非哺乳动物来源 如葡苷酸酶 人血液中低水平，催化能力弱，最适PH5.4 E.Coli B-G最适PH6.8 羧肽酶A 大肠杆菌硝基还原酶（NR）人体中NR对底物结构要求不同于细菌 c 哺乳动物来源酶碱性磷酸酶、半乳糖苷酶 降低偶联物免疫原性 影响特异性解决免疫原性：抗体或抗原结合域与酶或酶的催化部位组成融合蛋白，由E.Coli以活性形式生产,Tumor necrosis therapy utilizes monoclonal antibodies targetin

31、g intracellular tumor antigens on necrotic(dead)tissue.This method overcomes some of the limitations of current antibody-based therapeutic approaches.,抗体药物的研究和应用,理想的抗体药物的性质,高特异性和高亲和力（Kd=1081010L/M）对人没有免疫原性，不诱导HAMA反应游离抗体不激活补体一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养抗体符合生物制品标准,目前我国抗体药物发展的瓶颈,规模化动物细胞培养技术,工程抗体高效表达系统,今后抗体药物发展的方向,寻找新的靶抗原基于抗原立体结构设计抗体基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗体 模拟物,人源抗体制备技术日臻成熟，全分子人抗体研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，力争在国际竞争中占有一席之地。,可用单抗治疗的疾病,移植排斥,肿瘤,自身免疫病,心血管疾病,感染性疾病,过敏性疾病,