第6章：细菌的遗传分析.ppt

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1、第六章 细菌的遗传分析,重点：转 化、接 合、性 导、转 导,第一节细菌的一般特点,第六章：细菌的遗传分析,一、细菌的细胞与染色体1、大小:细胞较小、长约12、宽约0.5；2、结构：细胞壁、质膜、细胞质及内含物、拟核、核糖体、鞭毛；3.遗传物质：单个主染色体、一个或多个小染色体(质粒)；4.繁殖：每个细胞在较短时间内(如一夜)能裂殖到107个子细胞成为肉眼可见的菌落或克隆(clone)后代。,细菌细胞结构模式图,细菌细胞结构解析图,5、细菌的染色体,E.Coli,DNA,细菌基因组DNA由50100个环或结构域组成，各个结构域可保持不同水平的超螺旋.,分支点,超螺旋,6、细菌的繁殖方法,大肠杆

2、菌的培养通常用LB培养基：每升培养基含水解酪蛋白10克、NaCl 10克、5克酵母提取物，pH 7.0。制平板用的固体培养基还要加15克琼脂粉，然后高压灭菌。液体培养:37，280-300rpm。,二：E.coli 的突变型及筛选,1、细菌的突变型（1）、原养型：野生菌株则可在基本培养基上生长。用不同的选择性培养基 测知突变的特性。（2）、营养缺陷型：丧失合成某种营养物质的能力，不能在基本培养基上生长的突变型；（3）、抗性突变型：如抗药性或抗感染性。例如：青霉素（penr）抗性突变的菌落（4）、其它突变型：耐高温、降解环境污染物、某种物质的产量特高等。,2、测定突变的方法影印法,黎德伯格等(L

3、ederberg J.和Lederberg E.M.,1952)设计,Lederberg J.,1958 Nobel奖获得者，发现细菌转导和接合,3、细菌的遗传重组方式,一个菌株的DNA与另一菌株DNA的交换重组可以通过四种方式实现：.接 合.性 导.转 化.转 导,接合和性导是通过一种叫F质粒或F因子的介质将供体细菌的DNA转移到受体细胞中的。转导是通过噬菌体将供体细菌的DNA转移到受体细胞中的。,三、细菌的质粒,1、定义：质粒是细菌染色体以外的遗传物质，双链环状DNA，不是细菌正常生长和繁殖所必需，但可以使含有质粒的细菌具有一些独特的生物学特性。2、特征：,.可分为相容性与不相容性两种 相

4、容性：几种质粒共存于一个细菌内；不相容性：几种质粒不能存于一个细菌内。,3、重要的质粒,.质粒(致育质粒)：是决定大肠杆菌不同菌株细胞间遗传物质转移能力的一种致育因子(fertility factor),又叫因子、性因子(sex factor)。约为细菌组DNA的2，94.5kb，其基因组中包括转移、复制和插入等基因簇。,.耐药性质粒：编码重金属盐类和抗生素的耐受性,包括接合性(R)耐药性质粒和非接合性耐药性质粒。.毒力质粒或Vi质粒：编码与致病性有关的致病因子,如大肠埃希菌质粒编码的耐热性肠毒素(ST)和不耐热性肠毒素(LT)。.细菌素质粒：编码各种细菌素,如大肠杆菌Col质粒编码的大肠杆菌

5、素。.代谢质粒：编码产生各种相关的代谢酶,如沙门菌发酵乳糖的能力是质粒编码。,他们选择了两个不同营养缺陷型的 E.coli菌株A菌株：met-bio-thr+leu+,需加甲硫氨酸和生物素；B菌株：met+bio+thr-leu-，需加苏氨酸和亮氨酸。A+B 菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后离心，洗涤，然后涂布到基本培养基上培养，长出了原养型（Met+bio+thr+leu+）菌落。,第二节：大肠杆菌的性因子和接合,1946年，Lederberg和Tatum发现E.coli细胞之间通过接合可以交换遗传物质,一、大肠杆菌的遗传重组现象,大肠杆菌的遗传重组现象图示,频率为10-7,二、前述遗

6、传重组的特点,1、形管实验证明，遗传物质的传递需要细胞的直接接触,A、B两个菌株分别培养在装基本培养基的U形管内，U形管底部是细胞不能透过，而DNA等大分子能自由进出的隔膜。,不断地加压和吸引使培养液反复混合下培养，结果是两边的培养基上均未长出原养型细菌。直接接触(接合)是原养型细胞出现的必要条件。,2、接合过程是一种单向转移遗传物质的过程,海斯(Hayes W.,1952)的实验：,首先用高剂量的链霉素处理菌株1或菌株2（用链霉素处理菌株可以阻碍细菌的分裂，但不杀死它们），处理过的菌株1+未处理过的菌株2 基本培养基上有存活的菌落 处理过的菌株2+未处理过的菌株1 基本培养基上没有存活的菌落

7、不是一个交互的过程证明：接合过程是一种单向转移遗传物质的过程。,三、F 因子,F因子上具有4060个蛋白质基因,每个细胞内24个F因子。,F因子可整合到细菌的基因组DNA上，这样的细菌叫高频重组(Hfr)品系。,F因子可从F向F的转移。StrR就在F质粒上。,从F+到Hfr的整合过程,四、细菌的结合示意图,五、细菌重组的特点,单数交换：打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞因没有线性染色体的复制机制而不能成活。偶数交换：产生可遗传的重组子和一个片段。一次双交换只产生一种重组子。,六：中断杂交与基因重组,为了证明接合时遗传物质从供体到受体的转移是直线式进行的，Jacob和Wollman在五

8、十年代设计了一个著名的中断杂交试验。即用Hfr菌株与F-菌株混合培养。Hfr菌株：strS a+b+c+d+对链霉素敏感F-菌株：strR a-b-c-d-抗链霉素实验程序如下：,1、基本做法,得到结果是：在每个时间点取的样中，分别具有 a+、b+、c+或d+的菌落有多少。,2、实验原理,Hfr菌株：苏氨酸(thr+)、亮氨酸(leu+)、抗叠氮化物(azir)、抗T1噬菌体(tonr)、半乳糖(gal+)、乳糖(lac+)F菌株：thr、leu、azis、tons、gal、lac 型。,.8分钟时 thr+进入F；8.5分钟时 leu+进入F;.9分钟时出现azir的菌落；.11分钟时出现抗

9、噬菌体T1的F 细菌（tonr）；.18和25分钟时：分别出现乳糖和半乳糖发酵基因，即lac+和gal+进入F 细胞。,3、中断杂交实验结果,重组子中各标志基因进入F-细胞中时间不同，达到最高水平的时间也不同；随时间的推迟，有某个基因的菌落增加；一定程度后，便不再增加。如：10 tonr首次出现,15时40%、25后80%Hfr中的基因是按一定的线性顺序依次进入F-菌株的。,4、根据中断杂交实验结果绘制遗传图,以各个基因出现的时间(分钟)为单位，就可作出大肠杆菌的遗传连锁图。,在大肠杆菌中，通过实验知道平均每分钟转移33kb以后，还可将连锁图转换为基因组物理图。,5、环状连锁图,、用不同Hfr

10、菌株进行中断杂交实验，作出环状连锁图，其基因向F-细胞转移的顺序有可能不同：,为什么转移顺序是乱的？原因是，不同Hfr菌株的F因子插入的位置和方向不同!,、不同Hfr菌株的F因子插入位点,Hfr H：lacthr thi malA serA tyrA his recA att,Hfr H：thrlac att recE his tyrA serA malA thi,6、重组作图,两基因转移时间间距2分钟时，中断杂交法的图距不够精确，应采用传统的重组作图法。,例如，有乳糖不发酵突变体lac-和腺嘌呤缺陷型ade-两个菌株，这两个紧密连锁基因间的重组作图方法如右图所示。,结合的两基因间重组频率,l

11、ac-ade+重组率=100%=22%(lac+ade+)+(lac-ade+),中断杂交连锁图的每分钟约相当于20%的重组值。,一、F因子1、概念,第三节：F因子与性导,2、F因子的特点,.F因子转移基因的频率极高，如同 F+因子；.F因子自然整合率极高,并且整合在一定的座位上,携带了细菌染色体的同源区段。而正常F因子可在不同座位整合。.F因子可以携带的染色体节段大小：从一个标准基因到半个细菌染色体。,结合过程(F因子的转移),二、性导,1、性导的概念 通过F因子进行的遗传物质传递与基因重组叫性导。,2、性导在遗传研究中的作用.可分离出携带有大肠杆菌基因组不同部位的大量F因子，部分合子重组子

12、连锁遗传图；.性导部分二倍体等位基因的显隐性关系等；.性导形成的部分二倍体可用作互补测验确定两个突变类型是否属于同一个基因。,第四节、转化,1、转化的概念:某些细菌通过细胞膜摄取周围来自供体的外源DNA片段,并将其通过重组过程整合到自己基因组内的过程。外源DNA片段的导入方法很多。,一、转化（transformation）,2、转化实验由来已久：1928年格里费斯（Griffith F.）在肺炎双球菌中发现转化现象。1944年阿委瑞（Avery O.T.）进行肺炎双球菌转化试验；证实DNA是遗传物质供体DNA与受体细胞间的接触与互作。,3、转化实验仍在发挥重要作用基因操作技术离不开的转化实验(

13、酵母菌）.PCR产物的克隆鉴定、原核表达转化大肠杆菌.基因功能研究酵母菌双杂交转化酵母菌.研发转基因动物、转基因植物等 需要转化.基因功能研究基因扣除法 需要转化,4、转化过程中外源DNA的摄取,.穿入的DNA分子结合在接受座位上(可逆)，或被DNA酶降解；接受座位饱和性DNA摄取(不可逆)，不受DNA酶破坏。穿入后，由外切酶或DNA移位酶降解双链中的一条链。.剩下的单链按各个位点与互补的受体DNA片段联会。亲缘关系越远，联会越小、转化的可能性越小。.整合过程就是DNA重组过程，具有同源DNA特异性。,5、影响大肠杆菌转化的因素,、影响转化的因素包括：.片段大小:肺炎双球菌的成功转化，需要外源

14、DNA片段至少800bp,枯草杆菌最少需要16kb.片段形态:用于转化的外源DNA片段必须是双链.片段浓度:每个细胞摄取的DNA分子数10个.受体细胞生理状态；感受态。,、受体的生理状态活跃合成的蛋白质可使细菌细胞壁易于接受转化DNA,所以感受态是细菌处于生长周期的某一特定时间段、最能摄取外源DNA而被转化的细胞状态。具体讲，感受态是处于刚停止DNA合成、而蛋白质合成正在继续活跃地进行时的状态。常用的大肠杆菌感受态细胞有热击转化用感受态和电击转化用感受态两种类型。,二、用枯草杆菌进行转化和重组试验,1、紧密连锁的基因可以通过转化进行作图trp2+his2+tyr1+trp2 his2 tyr1

15、,共转化率:his2 tyr1 trp2 his2 trp2 tyr1,即his2在中间。,2、转化枯草杆菌三个基因的连锁图,第五节、转导（transduction）,1.概念：指以噬菌体为媒介进行的细菌遗传物质重组，是细菌遗传物质传递和交换方式之一。2.特点：,以噬菌体为媒介细菌的一段染色体被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内通过感染转移到另一个受体细胞内。所以，感染细菌的能力决定于噬菌体的蛋白质外壳。例如：黎德伯格与津德（1951）发现鼠伤寒沙门氏菌中转导现象。将两个沙门氏菌的营养缺陷型进行杂交：phe-trp-tyr-met+his+phe+trp+tyr+met-his-混合培养基本培养

16、基长出原养型菌落的频率为1/105,3、普遍性转导,.作用：可转导细菌染色体组的任何部分。,错误包装(1/1000机率),同源重组,转导颗粒：把细菌基因组DNA片段包装在噬菌体蛋白质外壳内而产生的假噬菌体（不包含噬菌体的遗传物质）,、测定细菌基因间的连锁关系,以普遍性转导噬菌体P1为例，测定大肠杆菌的leu（亮氨酸合成)、thr（苏氨酸合成）、azi(叠氮化钠抗性）三个基因的顺序,、三个基因间连锁关系的测定结果,（4）、通过共转导计算两基因间的物理距离(d),L=转导DNA的平均长度；X=两个基因共转导的频率。由以上公式可知：转导DNA的平均长度约为个病毒基因组的大小；通过试验测得两个基因的共转导频率，就可估算出两个基因间的物理距离。,4、特殊性转导:由温和噬菌体进行的转导,.溶原起始：噬菌体可在染色体一些特定位点上整合到宿主基因组,.裂解起始正常环出,由温和噬菌体进行的转导最后两步,6.特殊性的特点：特殊性转导又叫局限性转导，仅限于转移靠近原噬菌体附着点的基因。,4.再次整合：导致溶源性转导,5.或者不经过整合：重组性转导,大肠杆菌精细染色体图,应用中断杂交技术、重组作图、转化和转导相结合的方法已经得到细菌的非常详细的染色体图,1963年 E.Coli 遗传图,图距单位是分钟,