第14章基因工程.ppt

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1、Dolly,the first mammal to be cloned from an adult cell,Is shown here with her naturally conceived first lamb,Bonnie.,卵细胞（去核）B,乳腺细胞（6岁羊）A,细胞融合电脉冲,胚胎细胞,转移,子宫内发育C,Dolly的一生,1996年7月5日，生物学界发生了一件轰动世界的大事：克隆羊多莉诞生。1997年2月27日，英国自然杂志全文刊登罗斯林研究所的实验结果。1998年4月13日凌晨时生下一只雌性的体重2.7千克的小羊羔，取名“邦妮”。1999年，多莉一家又迎来了3个可爱的羊宝宝。2

2、003年2月14日，英国一个名叫多莉的克隆羊，因患严重肺病而接受“安乐死”。,第 二 节 重组DNA技术,DNA Recombination Technique,相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理 重组DNA技术与医学的关系,本节主要内容,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆个体克隆（动物或植物）,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的

3、或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。,DNA克隆(DNA cloning),（二）工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶T4DNA连接酶逆转录酶碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,-“缝纫针”,-“基因剪刀”,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶-“基因剪刀”,定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并

4、在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类、（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hind,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,BamH,+,Hind,+,平端切口 blunt end,粘端切口sticky end,同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别

5、和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,BamH,+,Bst,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,（三）目的基因（target DNA）“乘客”,cDNA(complementary DNA)反转录合成，与mRNA互补的单链DNA,基因组DNA(genomic DNA)一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列,（四）基因载体“交通工具汽车”,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体质粒

6、DNA噬菌体DNA病毒DNA,克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准,能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS）；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,1.质粒(plasmid),质粒：存在于细菌染色体之外的能独立自主复制环状双链DNA分子。带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状,目 录,ori,噬

7、菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,2.噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因的N端）M13mp系列pUC系列,3.粘性质粒(cosmid),一种人工构建的克隆载体，包含了噬菌体的cos基因。能被包装到噬菌体粒子中，感染大肠杆菌；它携带入宿主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病

8、毒，逆转录病毒）,其他,二、重组DNA技术基本原理,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,目 录,（一）目的基因的获取,1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。小分子多肽基因2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)（见第22章）,1*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,基因组DNA文库（genomic DNA library）将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全

9、部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库,2*从基因组DNA文库获取目的基因,cDNA文库(cDNA library)：以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。,C-文库具有组织细胞特异性。,3*从cDNA文库获取目的基因,DNA文库,目 录,Dr.Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖PCR(Polymerase chain reaction)是用一对寡聚DN

10、A作为引物，通过加温变性退火DNA合成的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经2530个循环后，扩增倍数可达106。,4.聚合酶链式反应,目的:用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR体系及基本反应步骤,（三）外源基因与载体的连接,1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,目 录,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割

11、位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目 录,2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,目 录,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,目 录,4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,目 录,受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transform

12、ation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA导入受体菌,1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹 2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,（五）重组体的筛选,a 互补,目 录,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,重组DNA技术操作的主要步骤,目 录,表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,原核表达体系真核表达体系,标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点,原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）,E.co

13、li表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白,大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,目 录,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累使用穿梭载体，有两套复制原点及选择标记缺点：操作技术难、费时、不经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,表达载体pFASTBACI 的物理图谱,目 录,（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研

14、究其性质，而认识疾病的分子机制。,三、重组技术与医学的关系,（二）生物制药,分子医学 molecular medicine,重组DNA医药产品,目 录,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,一种可靠的DNA诊断方法应符合：能正确扩增靶基因；能准确区分单个碱基的差别；本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗(germ line gene therapy),1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,小 结,1.重组DNA技术（基因工程）：分、切、接、转、筛2.分子医学涉及的内容,