第四节-单链丝状噬菌体载体.docx

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1、第四节单链丝状噬菌体就体一、M13噬菌体的生物学1. M13噬菌体的组成和结构M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体的基因组为单链DNA,由6407的碱基组成（GenBank注册号为V00604）o基因组90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因VO和基因IlI以及基因II和基因IV之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质，包括复制蛋白（基因11,V和X）,形态发生蛋白（基因I,IV和XI）,

2、结构蛋白（基因IIIVI.V11,VBI和IX）o所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组DNA为正链,按基因II至基因IV方向合成，与噬菌体的mRNA序列同义。图3-20是M13噬菌体的遗传图谱。图21:M13窟苗号的遗传图踽图21:M13近菌体Ife粒结构锲里M13噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长880nm,直径6-7nm。噬菌体颗粒的核心由2700个基因VlH编码的结构蛋白呈管状排列而成（图5-32）,成熟的基因VIH的产物为由50个氨基酸残基组成的螺旋蛋白。顶端由5个基因Vn和5个基因IX产物组成，作用于间隔区中的包装信号。5个基因III蛋白和5个基因VI蛋白位于丝杆的

3、末端，参与对性纤毛的吸咐。图3-21是M13噬菌体结构模型。2. M13噬菌体的增殖吸附是噬菌体感染的第一步，M13噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带F质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因III蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛,基因III蛋白与宿主的TolQTolR和TolA蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒DNA及附着于其上的基因III蛋白进入宿主菌体内。mchngmg*VtrandMlCWCUerWaIDNA.ConwrUMJbodoutltr*adfphC4MtownRFDNAbrM0-11coddzywwSMr.round*rspc4tionoccurt

4、hroughBlrucWMTd*.mRNAsTraig*wIiPtOdUCt11t(ucMaRtCAMPCC*rtImsarrow,g11y，strand*thdCefVb11uov三hrby*cvmoftheBIr.b11MMtwwyarowdtZMfAndinBMUIraMMQc*tlr0K4tacn)11wcompt(jprogeny)Mrand.tev*Wwo*ngoognvfranVWlC*euiMiMSyMhM*Hpf999rr9hltrandco11tmjM.图22,M13摩苗体i感染编胞中的复制在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA(正链)在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA,

5、用于DNA的复制，因此这种双链DNA称为复制型DNA(replicativeformDNA),即RFDNA。通过复制方式，RFDNA进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。M13噬菌体在感染细胞中的复制见图3-22o当基因II蛋白在亲代RFDNA的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的DNA聚合酶I的作用下，以负链为模板在切口的3,末端加入核昔酸，并持续DNA的合成，用新合成的DNA替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代

6、的正链由基因II产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组DNAo在感染开始的1520分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成RFDNA,然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链DNAo当感染细胞内累计有100-200个RFDNA时，细胞内也产生了足够的单链DNA结合蛋白，即基因V蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因11mRNA的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链DNA上，阻止其转化成RFDNA。此时，DNA的合成几乎只产生子代正链DNAo另外，基因X蛋白和基因V蛋白也是噬菌体特异DNA合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内RFDNA的数量。结果，感染细胞内RFDNA的数目和

7、子代正链DNA的产生速率都能保持适度。成熟噬菌体颗粒由H个病毒蛋白中的5个组成，至少4个其他蛋白(如基因I、IV和XI蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白(thioredoxin)对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。二、M13噬菌体载体单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RFDNA0RFDNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。1. 载体的插入位点在M13噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因11IV和基因Vm/III之间）。基因II和基因IV之间的508bp间隔区是主要的外源片

8、段插入位点。在基因W和基因III之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因X也可用来克隆外源片段。2. M13噬菌体载体组成现在所使用的M13噬菌体载体是Messing及其同事建立的mp系列载体，以基因II和基因IV之间的区域作为外源DNA插入区。mp载体系列都是从同一个重组M13噬菌体（M13mpl）改造而来的。在M13mpl载体中，间隔区内的为el11位点插入了一小段大肠杆菌DNA,引入互补筛选。3. M13mpl8和M13mpl9M13mpl8和M13mpl9这两个载体含有13个不同的酶切位点，可供插入

9、由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA片段（图3-23）oM13mpl8和M13mpl9DNA的全序列已经测定完成（GenBank注册号为M77815和L08821）,这两种载体只是在IacZ区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。图军23：M13l819的造传图IS当RFDNA被两种不同的限制酶切割以后，M13mpl8和M13mpl9轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成环。这一片段在M13mpl8和M13mpl9中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在M13mpl8的正链中含有外源DNA双链的其中一条链，而在M13mpl9正链中则含有外源DNA的

10、另一条链，即M13mpl8重组体的子代噬菌体内含有外源DNA的一条链，M13mpl9重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。故用M13mpl8和M13mpl9作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入DNA片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的DNA序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。三、M13噬菌体载体的宿主菌由于M13噬菌体通过F质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。Messing及其同事已经构建了许多携带F质粒并便于M13载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株，其中最重要的遗传标志有：（1） JacZDM15IacZ基因缺失突变体。（2）

11、 D（IaC-PrOAB）Iac基因缺失突变体。（3） IacIoiIacI基因的突变体。（4） proAB细菌染色体上脯氨酸生物合成酶类的编码区域。（5）抑制F因子接合转移的突变。（6） hsdRi7与hsdR4对大肠杆菌K株I类限制-修饰系统失去限制活性但仍保留修饰功能的突变体。（7） recAl大肠杆菌重组酶基因。（8） 琥珀抑制基因。在M13噬菌体载体中进行克隆时常用的宿主菌株如下。JMlOlsupED（lac-proAB）FtraD36proAB+lacIqIacZDM15JM105JMlOl/hsdR4JM107JMlOl/hsdR17JM109JMlOl/hsdR17recAlT

12、GlJMlOl/hsdD5（不修饰不限制）XLl-BluesupElac-hsdR17recAlF,proAB+lacIqIaCZDM15Tn10（Tetr）四、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题在丝状噬菌体载体的克隆中经常遇到两类问题。（1）外源DNA区段的部分缺失（2）外源DNA总是以单方向插入五、噬菌粒噬菌粒（Phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有ColEl复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。此间隔区含噬菌体DNA合成的起始与终止及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用序列。含噬菌粒的细菌被噬

13、菌体感染后，基因II蛋白可作用于噬菌粒的间隔区，启动滚环复制产生ssDNA并进行包装。克隆于这些载体内的外源DNA区段可以象质粒一样用常规方法进行增殖。而带有这种质粒的细菌被M13（或fl）丝状噬菌体感染后，在病毒的基因II蛋白影响下，质粒的复制方式发生改变。基因II产物与质粒所携带的基因间隔区相互作用，启动滚环复制，产生质粒DNA一条链的拷贝，最终包装在子代噬菌体颗粒中。pUC118和pUC119是功能比较完善的噬菌粒载体，对外源DNA片段的大小不那么敏感，并且保留了PUC质粒在克隆操作方面的优点(图3-24)o在pUC1819中增加了带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体

14、颗粒所必需的顺式序列(IG),当含这些质粒的细胞被适当的M13丝状噬菌体感染时,可合成质粒DNA的其中一条链，并包装在子代噬菌体颗粒中。通过纯化噬菌体颗粒，可制备单链DNA,用于DNA序列测定、定点诱变或制备探针。图3-24pUCUM19ftftWift噬菌粒具有以下特征：双链DNA既稳定，又高产，具有常规质粒的特征；免却了将外源DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤.由于载体足够小，故可得到长达IOkb的外源DNA区段的单链。噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源DNA的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源DNA区段常常由于太大而不能克隆于常规M13载体。但许多

15、噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链DNA的产量较低且重复性较差。六、M13KO7辅助噬菌体M13K07辅助噬菌体是M13的衍生株，大小为8.7kb,其结构组成见下图。M13K07噬菌体带有来自pl5A质粒的复制起点，因此可以象质粒一样复制，且可以与带ColEl的质粒共存于同一个宿主菌中。还带有一个来自转座子Tn903的卡那霉素抗性基因Qkanr),用作选择标记。基因II带有一个G至T的突变(第6125核昔酸)，导致基因II蛋白第40位氨基酸由甲硫氨酸变为异亮氨酸。辅助噬菌体M13K07的遗传图谱见图3-25。当M13K07感染带有噬菌粒的大肠杆菌后，如E.coli(pUC1

16、18),进入宿主细胞内的单链DNA,在宿主胞内酶的作用下转变为双链形式，后者可在质粒pl5A的复制起点控制下进行复制。由于细胞内M13K07双链DNA的积累并不需要病毒基因产物，细胞内的噬菌粒几乎没有机会干扰所进入的M13K07病毒基因组的早期复制。M13K07基因组双链DNA可表达产生子代单链DNA所必需的所有蛋白。但M13K07中突变的基因II产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒pUC118和pUC119中的病毒复制起点的作用有效，这就使噬菌粒正链DNA能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链DNA能够占据优势。图3-25.输助噬苗体M13KO7的造辅助噬菌体英文名称：helperphage;helpbacteriophage定义:通过对细菌的感染向某种缺陷性噬菌体提供后者所缺少的功能，使后者能够完成其感染生活周期的一种噬菌体。单链丝状噬菌体载体研究