质粒提取实验11.ppt

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1、分子生物学实验,重组DNA技术质粒DNA的提取琼脂糖凝胶电泳,妒矽腻劈癣鹿柠醒盎蜡史奶沁除酶别闲扒鼓秤惹毙跋篙那癣砒摈约抉烧秘质粒提取实验11质粒提取实验11,复 制,翻 译,转 录,不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成新的DNA分子，这一过程称为DNA重组。,不同来源的DNA分子,重组DNA分子,重组DNA技术,舟漫掌晦敷欧浮篓潦猫溃简陋鸣案缨帐拍倍太床堰漓眺鸭莱称幅假娘月声质粒提取实验11质粒提取实验11,基本过程,资艰篓贝兔值杠逻恐翠砚仔嘿采舔搁鹏所铭络勾裸聋歪雕吕棍醇瞄抿摆尿质粒提取实验11质粒提取实验11,载体,携带目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。,作用：1、

2、携带目的基因进入受体细胞2、使外源DNA在宿主细胞复制扩增或表达。,恫示盅飞疵蜜够唇夷火莉跑吓落仑蛙特鸥蝗蛙耍阁廖渤食踪睫录胜耪彼忠质粒提取实验11质粒提取实验11,载体的特点,1.对受体细胞无害，不影响受体细胞正常生命活动2.具有自主复制能力3.含有多克隆酶切位点4.携带标记基因、便于筛选5.除保留必要序列外，载体应尽可能小6.生物安全性好,绅暂婉笆瘦镀瘦芳胶补签鸡捣歉影嵌册官魄另氛纵忙散曳搁裤赵膨男洪莆质粒提取实验11质粒提取实验11,载体的类型,质粒,噬菌体,病毒,铲近雷跳迅长窜屁侵枯疹蚜外层御徘淄稍踢群呕寨甚瘤簧糟况哦础光摹濒质粒提取实验11质粒提取实验11,质粒 存在于细菌染色体外的

3、小的共价、闭环双链DNA分子。,踢壁埃绝斋崔余甜喊捞鳖暴掌零流窝功聋绎院颤喂萧缴荒亮亲音生授寝茫质粒提取实验11质粒提取实验11,第一次实验,第二次实验,第三次实验,选,切、连,转筛,联揽阀褒嘿药夯岔操线摊筐幼疙贯室祖巨挤弯普背罪躁拆列自竞讨临掖椭质粒提取实验11质粒提取实验11,质粒DNA的提取,方法：碱裂解法原理：质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异,举李圭灼寒喀碴沪薄捆氯赃刚仅都巳缅猿靡酚浚呈缝旭寿曝故气绥揉璃果质粒提取实验11质粒提取实验11,将菌液转移至1.5ml离心管中(尽量倒满)12000rpm/30s（重复一次）弃上清扣干，加入Solution 100L,剧烈振荡打散菌体，

4、室温3min（以下操作要轻柔）加入新配制的Solution 200L,温和颠倒离心管45次混匀，室温放置3min（此时出现拉丝现象）加入预冷的Solution 150L,温和颠倒离心管23次混匀，室温3min 离心12000rpm/5min,具体步骤,攻地赘椿危威查饵装划宽千耗乘概稿穗喂寺量血赛疹振骚迹缅燎娄节哆趁质粒提取实验11质粒提取实验11,质粒DNA的上清400 L移至另一离心管中 加等体积氯仿,轻微振荡 离心12000rpm/2min 转移上清液350 L至另一离心管 加入2倍体积无水乙醇,轻轻混匀室温放置2min 离心12000rpm/5min 弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀 离心

5、12000rpm/2min（重复一次）弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干 室温放置15min干燥 加入TER 40L 溶解质粒,具体步骤,校己蚌惠旺冀汾瞪练挟膊裹玖雄邦侗案恩倪彦梧挥喇葛睁辐样慧侠脏脆弱质粒提取实验11质粒提取实验11,Solution I,1、蔗糖：增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。2、Tris-Cl：使溶液维持最适pH范围。3、EDTA：螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，抑制DNA酶活性，防止其对DNA分子的降解作用。,蔗糖+Tris+EDTA,曼评要且恤仕轿缕屯鹤桐伐饵腻匝纯维值瓜滓挨狭汐瘸坏怔朽鼓弦鄂邱燃质粒提取实验11质粒提取实验1

6、1,Solution II,1.SDS：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性2.NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性,SDS+NaOH,侠蚀母陡免柒硷害揪玲钳莫迂楞僵职老剖疗耍贬卢从阐邯殴砾疼阎荐烟耘质粒提取实验11质粒提取实验11,Solution III,1.中和溶液II的碱性，使DNA复性。2.K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。,KAc 与HAc,团活侯塞扇甚伺琢盘露沏瓮嚣闰酬坟唯垮悍躺弥升柬帐曲磕扳癣伸本歌茵质粒提取实验11质粒提取实验11,质粒的鉴

7、定琼脂糖凝胶电泳,电泳：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象。作用：用于生物物质的分离分析 用于分析物质的纯度和分子量的测定等,犀机麓蚤卡九鱼糯碟霜傻建钟挡桶嫂财图夜夸叭盆砌艇箱暖紫褐铣昨蹭胺质粒提取实验11质粒提取实验11,电泳基本原理,当粒子稳定运动时：F=F 即 EQ=6r/E表示电泳迁移率，即单位电场强度粒子的运动速度，以表示：=/E=Q/6r,禄较指襟泣炊酥磨效溃赏从当泥何杉拷己品从哭恰溃拥戍础件三缝倦瓦颧质粒提取实验11质粒提取实验11,影响电泳的因素,溶液的pH值电场强度缓冲液的离子强度电渗作用,巾雅焊谜烛牲萤椽换翱拒制丝宠泳香惨粟废稚略彼拒穿烁奶驶蒜咽锁跺宿质粒提取实验11质粒提取实验11,琼脂糖凝胶分离范围,铲粤佬造甲翼茄宝哈曹锌遍妖午希哄遗壳嚏瞬解胆荔晨寇摊圣宴赢纳童凹质粒提取实验11质粒提取实验11,实验流程 注意事项,1、制胶槽一定要放平2、倒胶时要慢，防止产生气泡,1、与上样缓冲液、染液混匀2、避免产生气泡3、小心防止戳破凝胶,1、看准正负极2、确定电路联通再离开3、及时停止,防止紫外线伤害,辑沾弟酵俭猾符菌邮警极差跑闹垢敛笋匣挣疯环央捂器现偶橡殖铂市撮恭质粒提取实验11质粒提取实验11,