微生物生产抗生素.pptx

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1、微生物生产抗生素类药,目录,一.抗生素定义,传统的定义：抗生素（antibiotic）是微生物细胞产生的能以低浓度抑制其他微生物细胞生长的化学物质。现代定义：抗生素是生物细胞（包括某些微生物植物和动物）产生的能以低浓度抑制其他生物细胞生长或功能的化学物质。,概 述,抗生素是某些生物产生的具有生物活性的物质，它不但可以抑制其他微生物的发育与代谢，有的还可以抑制癌的发育与代谢，及具有抗血纤维蛋白溶酶作用。抗生素是人们使用最多的药物，也是制药工业中利润最高的产品。世界各国由发酵法生产的抗生素约400种，广泛应用的仅120种，其他主要是毒性大、成本高，无商业应用价值。抗生素生产为近代微生物技术中最大产

2、业之一，世界产量超过35000吨，不但在经济上占有重要位置，且为人类健康作了出巨大贡献。,概 述,第二次世界大战期间,英美科学家在早年 Fleming发现青霉素的基础上,共同进行了青霉素的开发,用紫外光照射处理低产菌种,提高其产青霉素的能力,采用玉米浆作为培养基的氮源,从而成功地开始了青霉素的工业生产,并建立了深层发酵技术,这是发酵工业的一次革命,成为抗生素生产的开端。抗生素的工业化生产主要是利用微生物发酵法，极少数抗生素如磷霉素可用法学法生产。此外还用天然产生的抗生素进行化学结构改造，制造各种衍生物。,二、抗生素的生物来源,微生物产生抗生素,1、放线菌产生的抗生素：链霉菌属：放线菌素、链霉素

3、等。小单抱菌属：红霉素（大环内酯类）、新霉素（氨基环醇类）诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素放线菌中以链霉菌属产生的抗生素最多，诺卡菌属较少。,2、细菌产生抗生素芽孢杆菌属：多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。3、真菌产生抗生素青霉属：青霉素、灰黄霉素。头孢菌属：头孢霉素,其他生物（动植物）产生抗生素,植物产生的抗生素，如地衣和藻类植物产生的地衣酸和绿藻酸，从被子植物如蒜和番茄等植物的组织或果实中制得的蒜素和番茄素，裸子植物如银杏、红杉等也能产生抗生物质。动物的多种组织能产生溶菌酶或一些抗生素，如从动物的心、肺、脾、肾、眼

4、泪、涎水中可提取出色素，有抗菌及抗病毒等作用。,三、抗生素产生菌的选育 1、抗生素产生菌的分离 2、抗菌性试验 3、抗生素产生菌的改良 1)人工诱变 2)原生质体融合 3)体外DNA重组,体外DNA重组,四、抗生素的提纯,微生物在发酵过程中会产生多种代谢产物，包括各种初级代谢产物和次级代谢产物以及培养基的固有成分，这些成分的存在影响抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必须经过精制。,抗生素提纯的基本步骤和原则3个基本步骤：发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制4个原则：时间尽量短；采用适当较低浓度；条件适宜，pH适度，温度适宜；防止杂菌污染。提取方法：吸附、萃取、离子交换、沉淀、色谱分

5、离、分子筛过滤、透析等。,抗生素的提纯,五、青霉素的发酵工艺,1、青霉素的作用机制、抗菌谱及稳定性,作用机制：抑制细菌的转肽酶，阻止细胞壁合成中的交叉连接步骤，使处于繁殖分裂期的细菌细胞壁的合成发生障碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞内因渗透压等原因发生溶解而死亡。抗菌谱：作用于大多数革兰氏阳性细菌及部分革兰氏阴性细菌。稳定性：弱酸性的有机化合物，干燥纯净的青霉素盐很稳定，pH5-7，6最稳定。,2、菌种,青霉素作为第一个具有临床应用价值的抗生素，1928年被发现，1943年在美国被首次实现工业生产。最早发现的产生青霉素的原始菌种是点青霉菌，生产能力很低，发酵单位2U/mL，不能满足工业生产要求，

6、所以被淘汰。现在主要采用的是产黄青霉菌，目前国际上青霉素生产最高发酵单位80000-90000U/mL.,2、菌种,生产菌种按其在深层培养中菌丝形态分为：丝状菌和球状菌；根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌。常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉菌。,为了提高产黄青霉菌的青霉素产量，使用诱变剂如：二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、X射线等。,3、当前青霉素的生产工艺流程,一般而言，青霉素的生产工艺流程需要有四个环节。第一个环节是通过培养基配制、蒸汽灭菌等工艺手段将原料加工为一级种子罐。与此同时，还要将青霉素菌、斜面母瓶、米孢子等经过相应处理后加入到一级种子罐中。第二个环

7、节是利用培养基配制和蒸汽灭菌等处理手段将原料培养成二级种子罐。第三个环节是在第二个环节的基础上加上发酵罐的处理，形成发酵液。最后一个环节则是将上述所获得的发酵液放在带放罐中，获得最终的发酵液，完成青霉素的发酵制备。,青霉素发酵工艺流程及发酵控制,（1）孢子制备,先将保存在砂土中的菌种孢子取出，在由甘油、葡萄糖以及蛋白胨所制备而成的培养基中进行斜面培养，经传代和活化。培养温度控制在26左右（最利于菌种孢子传代活化的适宜温度）。培养7d左右，得到单菌落之后，再传斜面，以同样的方式培养7d。然后就可以将所获得的斜面孢子移植到优质小米或大米固体培养基上，25，相对湿度45%-50%，培养7d，得到最终

8、的生产孢子。所获得的生产孢子应该经过摇瓶试验后，确定其效价与杂菌情况均符合相关规定后方可用于下一环节生产。可在孢子成熟后进行真空干燥，低温保存备用。,一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝培养基：葡萄糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、消沫剂等。接种量：200亿孢子/吨培养基空气流量：1：3（m3/m3min）搅拌转速：300-350 r/minpH：自然温度：271时间：40h,（2）种子罐培养工艺,（2）种子罐培养工艺,二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等接种量：10%空气流量：1：1-1.5（m3/m3min）搅拌转速：250-280 r/minpH：自然温度：

9、251 时间：10-14h,（3）生产罐培养工艺,三级罐：发酵罐培养基：花生饼粉、葡萄糖、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰胺、碳酸钙、玉米油、硅油温度控制：变温控制，不同阶段不同温度 较高温度（26），缩短生长时间；降低温度（22），利于青霉素合成。pH：6.4-6.6左右 根据pH补糖（补糖可是pH上升）空气流量:1:0.8-1.5（m3/m3min）搅拌速度：150-200r/min,发酵罐示意图,搅拌器,冷却水进口,放料口,无菌空气,培养液,冷却水出口,排气口,pH检测及控制装置,电动机,加料口,菌丝生长速度与形态、浓度,发酵稳定期，湿菌浓度可达15%-20%，丝状菌干重约3%，球状菌干

10、重在5%左右。在发酵中后期一般每天放液一次，每次放掉总发酵液的10%左右。,消沫,天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌前期：主间歇搅拌，少加油中期：搅拌、加油、稍微降低通气量（必要时，少量多次)后期：尽量少加消沫剂,青霉素的发酵过程控制十分精密，一般2小时取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、青霉素效价等指标，同样取样做无菌检测，发现染菌立即结束发酵，视情况过滤提取，因为染菌后pH波动大，青霉素在几小时内就会被全部破环。,(4)青霉素的提取工艺,青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、

11、快速,青霉素的提取工艺,发酵液预处理萃取脱色反萃取过滤洗涤干燥（发酵液中，青霉素浓度较低 10-30kg/m3）发酵液预处理：浓缩目的产物，去除大部分杂志，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程 a.加絮凝剂使蛋白质沉淀 b.过滤（鼓式真空过滤机）,活性炭,萃取工艺过程：二级逆流萃取A、萃取原理：分配定律，青霉素在水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有机溶剂中，青霉素盐易溶于水，不溶于有机溶剂。青霉素在滤液中以盐存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有机相中，在醋酸丁酯中加入碳酸钾，6.8-7.4，形成盐转入水相中，实现反萃取。,B、影响萃取因素pH：反复调节pH，青霉素不稳定，易发生降解、异构化

12、、重排，-内酰胺环是功能性。温度：加热会加快其降解反应工艺过程及浓缩倍数，级数越高、纯度越高但收率越低。微生物污染：杂菌：-内酰胺酶和青霉素酰胺酶萃取时间：青霉素在水中的半衰期18.5min。,(5)青霉素的精制 制成碱金属盐：碱金属盐稳定性大；青霉素在水中的稳定性差，水解快。1)结晶工艺：A、醋酸丁酯中直接结晶：加入醋酸钾-乙醇-碳酸钾、丁醇-水真空共沸蒸馏。B、丁醇-水共沸结晶：青霉素的碱金属盐溶于水，在丁醇中不溶解，稳定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇带出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。2)过滤、洗涤、干燥 结晶后用真空抽滤来处理母液，并用丁醇洗涤。干燥采用真空双锥旋转

13、干燥器,(6)溶媒回收 采用立式传质塔蒸馏回收。,一、斜面培养：淀粉1，硫酸铵0.3、玉米粉0.61.0、氯化钠0.3、蛋白胨0.2、琼脂2、pH7.07.237培养710d，成熟的孢子灰色略带微红色。一级种子培养：豆饼粉2.5、葡萄糖3、淀粉4、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸铵0.5、玉米粉0.2、氯化钠0.3、磷酸氢二钾0.06、硫酸镁0.025、豆油0.335 培养72h，菌丝密集,六、红霉素的发酵生产,二级种子：豆饼粉2.2、葡萄糖3、淀粉4、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸铵0.1、玉米粉0.8、氯化钠0.3、碳酸钙0.6、豆油0.335，24h，接种量10二、发酵罐培养发酵培养基

14、：豆饼粉2.4、葡萄糖3、3.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸铵0.1、玉米粉0.8、氯化钠0.3、碳酸钙0.6、豆油0.15，丙酸0.6（分次加入）60h前35，60h后33,菌丝繁殖期：接种45h后，菌丝生长快，繁殖旺盛，迅速利用N、C，菌丝体密集成网状。红霉素分泌期：45h150h，菌丝体生长减弱，并达到平衡，pH在7.2左右，c源利用较快，红霉素持续分泌。菌丝自溶期：菌体衰老，发酵液颜色较深，菌丝短，粘稠度较大，pH上升7.5，氨基氮上升。,三、红霉素的提取和精制,红霉素是一种有机碱化物，在碱性条件下溶于有机溶剂中，在酸性条件下溶于水中。,提取工艺,发酵液 过滤 滤液 酸化液,加甲

15、醛、硫酸锌,pH8.28.8,(26000 r/ml),加氢氧化钠静止,碱化,调节pH1010.5,分层、离心,醋酸调节pH55.5,静止分层,酸化液,5加丙酮,冷冻结晶,结晶,洗涤,干燥,成品,1、发酵液预处理0.10.2甲醛：杀菌使蛋白凝集变性46硫酸锌：去除酸性蛋白，助滤并用碱液调节pH8.28.8，稳定红霉素2、滤液处理计算添加醋酸丁酯添加量，用碱液调节pH1010.5，3033左右，红霉素溶解于有机溶剂中。,气流干燥 80-90C,3、醋酸丁酯液处理：10醋酸调节pH55.5，分层，去除醋酸丁酯液，在酸性环境下溶于水溶液中分层过滤酸液处理用10氢氧化钠调节pH78，再加适量的醋酸丁酯，二次萃取。静止分层最终得到溶解于水中的红霉素再经过冷冻结晶，真空干燥得纯品。,