药物分析方法开发经验总结.docx

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1、药物分析方法开发经验总结一、常规化合物：首先，看化合物是否有紫外吸收（这里的紫外吸收包括较微弱的紫外吸收，例如化合物只含有BOC基团、只有少量碳碳双键，或同时含有少量不饱和键与Br原子等）；若有紫外吸收，且没有对水很敏感的基团（在HPLC中会水解），则暂定使用HPLC进行分析；若无,且沸点不是太高（400以下）的话，则暂定使用GC进行分析。备注：若紫外吸收太弱，例如：只有在20Onnl波长下才能出峰,峰高很低且峰型较差时，可根据化合物的沸点和性质选择使用LC-ELSD/CAD/MS检测器或用GC进行分析。此处如果是单纯看中控转化率，该方法也可以使用，此时需要尽可能降低背景吸收（采用磷酸或磷酸盐

2、-乙晴的流动相体系），但如果是最终产品需要测定化合物的纯度，这种做法就不行了。二、常见的几种情况如下：1 .对于有紫外吸收的化合物，需要进一步看化合物的性质，特别关注的点有：化合物的PKa（酸碱性），化合物的IogP（极性）以及化合物在酸、碱性条件下是否会水解。若化合物会水解，则需要考虑其他检测方法。（1）若化合物为酸性，则需要使用酸性流动相（在水相中加入甲酸，三氟乙酸，磷酸，高氯酸等），一般从005%0.1%的浓度开始；或者可以使用缓冲液（浓度一般从510mM开始，如磷酸盐，碳酸镂，甲酸钱，乙酸钱等，采用磷酸/甲酸/乙酸/三氟乙酸调PH至酸性）。刚开始可采用甲酸/甲酸俊/乙酸俊-乙晴体系作为

3、流动相以适配LCMS；（2）若化合物为碱性，则需要使用偏碱性的流动相（磷酸钾，碳酸镂，甲酸镂，乙酸镂，磷酸氢镂，三乙胺/二乙胺水溶液等，有需要的话还可以用氨水或三乙胺调PH至碱性）。刚开始可采用IOmM甲酸镂/乙酸镂水溶液-乙月青体系作为流动相以适配LCMS；（3）有机相首选乙晴（截止波长低，粘度小，洗脱能力较强），如果分离出现问题或者样品在乙晴中会坏掉，再选择甲醇。如果还有分离不开的现象，有机相可以采用乙月青，甲醇与THF中的任意两种进行混合，调整混合的比例以得到合适的分离度。（4）若化合物为中性，则首选IOmM醋酸镀水溶液，也可以换成水作为流动相（仪器设备紧张时），但水作为流动相不太建议，

4、除非能够保证方法开发，验证以及转移阶段用到相同性质的水，否则不同的纯化水可能会具有不同的pHo（5）对于液相色谱柱的选择，通常都从常规C18色谱柱开始尝试，同时需要注意色谱柱PH的耐受范围。对于某些特定结构的化合物，还可以使用苯基柱，氧基柱，氨基柱，五氟苯基柱，HILLIC色谱柱（化合物极性大的时候可以尝试使用，此时需要特别关注该类色谱柱的使用说明）等特殊色谱柱。（6）当HPLC分析方法中分离度不好时，首先尝试调整梯度（同时将梯度变陡或者变缓）。如果调整梯度有分开的趋势，则可以继续尝试，如果没有，则需要考虑更换色谱柱或者流动相。此时需要根据化合物特定的基团来进行评估。比如化合物结构中苯环或类似

5、结构较多，可采用苯基柱；若卤素元素较多，可采用五氟苯基柱等。（7）液相色谱柱，当填料相同时，内径越细，颗粒粒径越小，得到的分离度、灵敏度以及色谱峰的塔板数会越高（峰会变得更高更瘦）。但此时压力会上升。需要根据需求选择HPLC或UPLC,同时需调整流速。（8）在液相分析中，有一种类型的化合物（带醛基的化合物）比较特殊，有时候会出现峰型展宽的现象。这可能是由于化合物会出现醛基和烯醇基互变的现象，此时可以尝试60的柱温以及采用高氯酸或强碱性（pH911）的流动相，用以改善该类化合物的峰型。2 .对于没有紫外吸收的化合物，若沸点在400以内（根据数据库查询到的数值）且高温下不会分解，结构不会发生变化，

6、则可采用GC进行分析。后续根据化合物的特性基团、极性大小以及沸点高低，选择合适的色谱柱以及气相色谱仪的参数。（1）带氨基的化合物，可根据极性不同采用Rt-5AmineCP-Volamine（低极性）、Rt-35Amine（中等极性）以及CP-51WaxforAmine（高极性）等色谱柱。（2）酸和醇类的化合物一般极性较大，可采用DB-FFAP（酸），HP-INNOWAX等色谱柱进行分析。（3）普通化合物：可采用DB-I和HP-5（低极性）、DB-1701（中等极性）以及DBTAX和HP-INN0WAX（高极性）色谱柱进行分析。（4）盐酸盐类化合物：由于盐的沸点非常高，此时可采用吸附树脂或DBU

7、的甲醇/乙晴溶液将盐酸盐除掉，然后将游离态（不带盐酸盐的化合物）进气相进行分析。也可以用液碱（氢氧化钠/碳酸氢钠水溶液）去除盐酸盐，之后采用有机溶剂对溶液进行萃取，将脱掉盐酸盐的化合物萃取到有机相中，进GC进行分析。（5）若化合物沸点超过了柱子的最大耐受温度，并不是不可以分析，因为在GC的载气以及高压条件下，化合物的沸点会有所降低。此时可采用膜厚较薄的色谱柱,这样更利于将高沸点的化合物“吹出”。目前还有一些GC色谱柱的柱温可达到400o（6）采用气相分析时，溶剂的选择也有讲究，如果化合物沸点在IO（TC以上，则可采用甲醇，乙晴，二氯甲烷等沸点较低的溶剂（直接进样尽可能避免用到水，即使要用，水量

8、也必须很少）；如果化合物沸点较低（IO（TC以下），则可采用DMF,DMSO或者NMP这类沸点较高的溶剂，这样可以避免溶剂峰对化合物以及相关杂质的干扰。（7）载气类型的选择也有讲究，通常情况下，首选氮气，因为其便宜，且具有较好的惰性。如果采用氮气时灵敏度达不到或分离度达不到，可以尝试采用氢气和氢气，目前氨气使用的情况越来越多，氢气由于具有危险性，使用的较少。（8）如果气相出现分离度不佳的情况，首先尝试将升温程序变缓，如果效果不好，可以从载气和色谱柱上下手。色谱柱的话需要换成内径更小的柱子。载气可以将氮气更换为氨气。（9）气相色谱柱的膜厚越厚，可以消除一部分化合物极性高所带来的峰型不好的影响，如

9、果0.25um的柱子不合适，可采用l35Mm的色谱柱。例如有些带竣基的化合物，如果没有FFAP的柱子，也可以尝试用DB-I的柱子，膜厚选用35rn（IO）气相色谱柱，极性越强，膜厚越厚，则相应可耐受的最大温度越低。在进行色谱柱选择时需注意。在线直播I欧美及WHO法规、迎检策略、483、警告信及缺陷整改回复实战演练三、特殊化合物：1 .氨基酸类化合物：此类化合物极性很强，在GC中即便使用强极性的色谱柱也无法使其峰型变好。此时需采用液相进行分析。若该氨基酸有紫外吸收，则相对简单一些，通常有以下两种选择：（1）使用高氯酸（最强酸，抑制化合物解离）、五氟丙酸或七氟丁酸甚至九氟戊酸（离子对效应）使其保留

10、时间往后推移，但此时紫外吸收波长不宜太低（在205nm以下），否则会由较高的背景吸收，干扰化合物的出峰。（2）采用HILLIC模式，使原本极性很强的氨基酸类化合物的保留时间变大。但此时需注意HILLIC模式以及相应色谱柱的使用条件（柱温，有机相比例不超过50%等）。（3）若该氨基酸没有紫外吸收，则需要采用ELSD或者CAD检测器进行检测。流动相采用五氟丙酸或七氟丁酸，使化合物保留时间往后移。（此时的重点是调整检测器参数，雾化温度、漂移管温度等,以得到较合适的灵敏度。）2 .有紫外吸收但是遇水水解的化合物（硼酸酯类化合物等），此时有以下几种解决思路:（1）使用正相色谱进行分析，采用纯有机相作溶剂

11、，防止其水解。但需要评估其在有机溶剂（正相流动相、甲醇或乙醇等）中的溶解性以及出峰情况。（2）换用GC进行分析，但此时需要评估其高温是否稳定以及沸点如何。（3）如果沸点太高，需尝试对其进行硅烷化衍生以降低沸点，评估衍生条件后采用GC分析。（4）还可以采用衍生的方法，尝试将容易水解的基团衍生掉，评估衍生条件后采用HPLC进行分析。3 .没有紫外吸收但高温不稳定的化合物：（1）此时可以使用HPLC-ELSD/CAD的方式进行分析，也可采用LCMS进行分析，查看TlC流或者通过提取分子量的方式（SlR模式）对化合物及相关杂质进行分析。（2）可以使用衍生的方法使其具有紫外吸收。如果对于特定基团的化合物

12、（卤素等），还可采用ECD检测器进行尝试分析。4 .无紫外吸收且沸点很高的化合物：（1）采用衍生的方式，将没有紫外吸收的化合物衍生上具有紫外吸收的基团（丹磺酰氯、FnlOC-Cl等，需要化合物有活泼氢），进而采用HPLC进行分析。此时重点是搞清楚衍生条件，使得衍生可以完全，且衍生试剂的色谱峰不能对分析检测有影响。此类型的衍生一般会在碱性条件下进行，此时需要确认化合物是否会在碱性条件下坏掉。（2）采用衍生方式，采用硅烷化试剂对化合物进行衍生，进而降低其沸点，使其可以采用GC进行分析。此时依然要搞清楚衍生的条件，且衍生试剂的峰不能对分析检测有影响。硅烷化衍生时，需要在6070C的温度下，将样品与硅

13、烷化试剂反应0.5lh,然后对样品进行过滤后进样检测。（3）使用HPLC-ELSD/CAD的方式进行分析，也可采用LCMS进行分析，查看TIC流或者通过提取分子量的方式对化合物及相关杂质进行分析。5 .无紫外吸收且极性很大的化合物（酸性化合物,带2个竣基）：同4中内容。此时硅烷化不仅是为了降低沸点，也是为了降低极性，使化合物的峰型更好看，更对称。四、异构体（对映异构体）分析：1 .有紫外吸收的异构体：（1）使用正相色谱进行分析，通常先从ADT的色谱柱开始尝试，并进一步调整流动相比例以及种类，常用流动相为（正己烷/正庚烷-异丙醇/乙醇）；此时也需要根据化合物的性质（酸碱性）在流动相以及溶剂中添加

14、酸/碱（常用三氟乙酸/二乙胺等）；（2）如果是氨基酸类化合物，此时采用常规的正相色谱柱无法有效进行分离，则可采用硅酸类（冠醴类）固定相的正相色谱柱，在正相或者反相的条件下进行化合物异构体的分离；此时，流动相中需要加入缓冲对以降低氨基酸类化合物的解离。（3）如果该化合物沸点不是特别高，且HPLe不适用的情况下,可以尝试采用GC,使用气相色谱专用的手性柱（Rtx-BDEX225等）进行分析。2 .无紫外吸收的异构体，通常有3种解决思路：（1）采用GC进行分析，此时需要用到气相专用的手性柱。有些化合物则可能需要进行进一步的衍生才能使异构体之间得到分离。例如乙酰化等。（2）可采用衍生的方式使其具有紫外

15、吸收，再以常规的正相/反相色谱对其进行分析。此时的重点依然是要评估好化合物的衍生条件。（3）采用HPLC串联ELSD或CAD检测器的方式进行检测，色谱柱需使用反相的手性柱。因为正相色谱的流动相体系不容易挥发，最好使用反相色谱的流动相体系。五、残留溶剂分析：1 .常规化合物的残留溶剂：采用直接进样或者顶空进样的方法进行检测（根据溶剂本身的沸点，特性以及灵敏度）。若是胺类化合物需采用胺类专用气相色谱柱，酸性化合物用FFAP的色谱柱等。常规的一些残留溶剂，使用DB-624色谱柱可以覆盖大部分。这里需要注意的是，有些溶剂并不可以使用顶空进行分析（比如非常容易挥发的化合物），此时需查阅相关文献，后续改为

16、直接进样的方法进行检测。2 .盐类化合物/无机盐的残留溶剂:此时需要用水作为溶剂，故不能采用直接进样的方式进行分析。须采用顶空进样的方法。且顶空参数中的炉温（OVEN）不能高于90（最好不超过85）。六、杂质分析：1 .常规杂质分析：对于未知杂质，首先需要看看此杂质是什么结构（LCMS&GCMS&NMR等手段）以及杂质在当前的分析条件下会不会出现变坏降解的情况，后续需根据杂质的检出水平，工艺对杂质的去除能力（或杂质去向）以及杂质对于最终产品的风险大小来制定合适的限度，比如：0.05%,0.5%,0.1%等。如果是已知杂质，则可以更方便的评价其风险以及工艺过程中的杂质去向。除此之外，更重要的是要

17、搞清楚杂质与主成份的响应差异。液相方法用到的IJV检测器比较多，通常是根据杂质与主成分的最大吸收波长来确定分析方法中的波长。当然，不同检测器的条件下，杂质与主成分的响应差异都是不一样的，如果杂质可以做出来或买到，就需要与主成分在相同浓度下比较响应差异，后续的方法开发中也要进行初步的校正因子的考察，为后续的方法验证做准备。如果是气相方法，FID检测器用到的比较多，此时需要根据杂质和主成分之间含碳量的多少来看响应差异。也需要做一下杂质与主成分在相同浓度下的响应差异以及初步的校正因子。如果响应差异太大,则需要谨慎评估该杂质的限度制定。上述工作都是为了更准确的确定杂质的含量。2 .特殊杂质分析:如果是

18、基因毒性杂质或者限度需要控制很低的杂质，此时常规的分析方法灵敏度不一定可以达到。就可能要采用LCMS的SIR模式，GCMS的SIM模式,LCMSMS仪器,柱前/柱后衍生或者顶空进样方式（顶空进样主成分可以过载很多）来进行分析。还可以根据杂质的特性选择特异性的检测器如电导检测器或ECD检测器对其进行检测。根据具体问题选择相应的检测方法。3 .金属离子/元素检测：此时可采用ICP-MS（电感耦合等离子串联质谱）和ICP-QES（电感耦合等离子串联OES）或者AA（原子吸收光谱-石墨炉）进行分析。有些情况下还可以使用离子色谱进行分析。当使用ICP进行分析时,化合物需要是溶液的状态，如果可溶于水，则比

19、较方便，可以直接用水配样进行检测，如果不溶于水，则需要加入硝酸或其他试剂进行消解，也就是将化合物结构破坏掉，最终用水定容，进样检测。消解的时候需要有专门的消解仪进行加压加热消解，而且加入酸的量也不能过高，否则会污染ICP的进样锥，导致检测结构不准确。4 .离子检测：多数情况下采用离子色谱进行检测，离子色谱通常配备的是电导检测器。需要根据离子的种类采用不同的模式。对于阴离子，流动相首选氢氧化物、碳酸盐等。对于阳离子，流动相首选硫酸，甲基磺酸等。流动相中一般没有有机溶剂或仅有微量的有机溶剂。色谱柱的选择则根据不同的离子种类选择特定的离子色谱柱以及预柱。对于某些离子的检测，还可以采用衍生的方式，使其

20、反应后具有紫外吸收，这样便可以采用HPLC进行分析，此时，评估衍生的条件以及专属性非常重要。七、水分检测：对于水分测定，目前最常用的有两种方法，一个是干燥失重，一个是KF法。KF法比较快速，比较灵敏，所以目前最常用。干燥失重需要根据化合物的熔点来设定干燥时候的温度以及条件。（1）对于可溶解于KF试剂的且不会污染电极的化合物，可以直接用KF水分仪进行滴定，若化合物中含有醛或酮，则需要采用醛酮类的KF试剂进行水分测定；（2）待测物如果是酸性化合物，需要往里加入一定量的碱（咪嗖等），如果是碱性化合物，需要加入一定量的酸（苯甲酸或水杨酸），以防止测定结果不准（KF滴定在pH5.58的范围内进行的最快，

21、所以PH不等低于4,也不得大于8）；（3）待测物如果是液体，可以直接分析，如果是固体，需要碾碎，且如果不溶于无水甲醇时，需要采用助溶剂（乙月青、甲苯，甲酰胺和氯仿等）进行助溶或采用其他的溶剂代替无水甲醇；（4）当水分含量多或者少时，为了获得更加准确的水分检测数据，KF滴定剂的浓度可以进行选择，水分含量多（样品易吸水时），可选择高浓度的滴定剂（5mgml）,反之，选择低浓度的滴定剂。要保持最终的消耗体积在1.53.5ml为宜。（5）以下情况不能用KF法测定水分：化合物与KF试剂反应（例如：盐、氢氧化物与氧化物-与KF试剂中的Hl反应；强酸-与甲醇发生反应生成水；醛酮类化合物-与甲醇化合形成缩醛或

22、缩酮并释放水分；硅烷醇和硅氧烷-与甲醇酯化生成水；金属过氧化物；强氧化剂-与KF试剂反应；含硼化合物：硼酸和甲醇发生脂化反应生成水。等）。样品会消耗碘或释放碘（例如：铁盐、酮盐、亚硝酸盐、硫代硫酸盐等），会导致水分结果偏高。（6）若化合物会污染电极，或不溶于KF试剂，则此时不能采用常规的KF法进行测定，需要使用干燥失重或是带加热炉的KF水分测定仪。将水分蒸发出后吸取到滴定模块，进而进行水分测定。八、滴定分析：通常用于化合物的含量测定以及某些离子（如氯离子）的测定。通常都是酸碱滴定（水溶液与非水溶液滴定）、氧化还原滴定（镒量法，碘量法，铺量法，重格酸盐，重氮法）、络合滴定（EDTA滴定）以及沉淀

23、滴定（浊度与银量法）。（1）对于酸碱滴定，就需要选择合适的酸或者碱。有竣基，一般使用NaOH,有氨基，一般使用高氯酸或盐酸。在非水滴定（当带测物的酸性和碱性弱、不溶于水或与水发生反应时使用该模式）中，通常会有盐酸的异丙醇溶液，高氯酸的冰醋酸溶液，氢氧化钾的乙醇溶液，甲醇钠的氯苯溶液，四丁基氢氧化镂的异丙醇/甲醇溶液等。（2）对于氧化还原滴定，需要根据滴定时发生的反应去选择合适的指示剂以及滴定液（碘标液、硫代硫酸钠、高镒酸钾、碘酸钾、硫酸锦、滨标液、溟酸钾、重格酸钾等），目前用到电位滴定比较多，故指示剂用到的比较少。(3)对于盐酸盐类化合物，如果要进行滴定，需要加入一定量的醋酸汞将盐酸屏蔽掉，再用高氯酸进行滴定。(4)但如果待测化合物以及其相关杂质均含有相同的基团(例如都有氨基)，此时滴定测含量是不准确的，因为杂质也会消耗滴定剂。(5)在滴定的时候，滴定仪的参数选择也会影响结果，比如搅拌时间，滴定的速度，阈值设置等；止匕外，滴定液的浓度，电极的使用也会影响到含量结果。这些都是需要注意的点。(5)这方面内容需要根据经验积累，可以翻看药典种的滴定方法以及网上的文献资料。加强对滴定分析以及电位滴定仪的了解。