辽宁花生疮痂病病原学及侵染特性研究.docx

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1、,塔修茨孝人冬论文题目：辽宁花生疮痂病病原学及侵染特性研究独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名:时间：年月日导师签名:时间：年月日关于论文知识产权和使用授权的说明本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的史印件和遨盘，允许论文被查阅

2、和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等组制手段保存、汇编学位论文同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名:时间：年月日导师签名:时间:年月曰CONTENTSAbstract1Abstract(inEng1.ish)3Chapter I Researchprogressinfunga1.diseasecausedbySphace1.omas51 CharacterizationandC1.assificationofSphaee1.omaspp52 Typi

3、ca1.symptomsofdiseasecausedbySphace1.omaspp52.1 Citrusscab52.2 Grapeb1.ackpox62.3 Supcr-c1.ongationdiseaseincassava62.4 Peanutscab72.5 Otherfunga1.diseasecausedbySphace1.omaspp73 Theoccurrenceru1.esofdiseasecausedbySphace1.omiispp84 ThepathogenicmechanismofSp1.uice1.omaspp94.1 E1.sinochrome94.2 Gibb

4、ere1.1.in1()4.3 Resistanceofcu1.tiv372JNy40547JN99261KE1.xinoefdwei1.iiCK18570Brazi1.JNW503JNgO385JN94O565JN992654CPe1K535Brazi1.JN9434%JNWO382JNg4O5S9-S-CrythriiKteCPC18530Brazi1.JVM3502JNM0W2JN94O566JN992636CK：18542Brazi1.JNM34X7JNM(Wico1.aCBS124765AuNni1.hGQ3U327SGQ3O33O6-SjerrfiinaIiMtCK?18538Br

5、azi1.JNWM97JNgO3，JN94O56()JN992629EirwruArTo1.IDI853USDQ76765IDQ767658-AFTO1.-IDi360USADQ678OO7DQ678()60Etw心EArUnICBS120084AUyni1.b1.DQ92353O-Et!rAFTo1.IDI855USADQ67MH2DQ67SW5E.cenimt(kbiAKK1.-ID1854USADQ67MMIDQ67S9489jSpMcazCrAtrn“CPCI8S3O1iJSphcmntHurC7C18M2*1.ke*bm/QrfcfuCPC18M0E1.riMur”5/向OkCBS1

6、.24M9-(vr/vutrCTC18561巴一Sphacmat/HhdrCPC1.$SJ8rKMjumMWCPCItSNoEI电swtoWAFTO1.-ID1854HjF1.rfMa/pw0tfFTO1.4D1S5SgJrE1.suw/vut1.FTO1.-ID18.SSU.RPBD3结论与讨论花生疮痂病可影响花生挖个生长期，主要危害部位为叶片、托叶、叶柄、茎部及子房柄，各患部能形成木栓化疮痂氏,该病害的侵染可影响到植株的生长情况，导致花生叶片提前脱落，还可对果实的成熟度造成影响，致使花生产量大量的损失.2010起，花生疮痂病在辽宁省造成了严克危害，张丹等(2012)监测显示，2011年辽宁

7、省花生主产区疮痂病危害范用共计可超过12万hnr,阜新产区疮摭病危害范围为7万hnr,其中3万hnF危害严重：葫芦岛花生产区疮痂病危害范闱2.67万hm，其中1.33万hnF危害严重;锦州市花生产区疮痂病危害范围1万hm2,其中i333hn2危害严重,沈阳市花生产区疮痂病危害范圉为1.33万h11.2012年辽宁花生主产区疮痂病发生程度较2011年相比略仃增K，阜新地区和沈阳地区增幅最大，个别乡镇病株率可达到80%以上，整体分布有向东、向北传播趋势.20142015年调查发现，花生疮揄病发病面积进一步扩展,辽宁省东北部昌图地区已发现花生疮痫病发生与流行。由于天气干不以及病田施药防治等原因，近两

8、年花生.疮痴病病情严重度有所卜,降，但依然是辽宁花牛.疮痴病主要病需之O调查发现连作重茬在辽宁省各花生产区普遍发生，将成为我省未来花生生产上面临的主要问超。病原菌从一个地方传播到另一个地方，需要一个定殖和积累的过程，连作重茬为病原菌定殖和菌源积累提供了有利条件，导致菌源数量在土壤中不断枳累，流行危害并为病害传播到下个地区提供菌源基础。疮痂病是辽宁新流行花生病害，并逐步北移蔓延全省，2010年辽宁兴城个别花生产区发现花生疮痴病的发生(赵庆林，2010).2011年辽宁省胡芦岛、锦州、阜新等花生产区花生疮痂病爆发式流行，造成严重的产量损失(周如军，2013),2014年花生疮痂病已在辽宁全省主要花

9、生.产区发生流行。调查还发现花生栽培品种对病害影响较大，花生品种白沙1016比较感病，而臼沙1016为辽宇主栽花生品种，种植年限长，抗病性较差，是造成花生疮痂病在辽宁潦行成灾的主要因素之一.轮作是解决连作近存导致严玳病害问甥的措施之一，辽宁省花生产区多为沙壤地，轮作困难，如何合理调整种植结构.响应中央供给侧结构性改革方针,是我省花生产业需面临和解决的重要问题.痂圆袍屈其菌生长缓慢，菌落形态特殊，分离过程中又易被杂菌污染，因此分值难度极大(何胜强，1997：Emechcbc,1980；Sompong.2012),国内尚未见花生疮加病菌人工分离成功的报道。本文首次成功分离出辽宁省花生疮痂病菌，并对

10、其进行形态学和分子鉴定，确定花生疮痴病菌为落花生伽圆抱菌Sphace1.omaarachidis.关于该病菌的分生的子类型，国内外学者有不同报道，日本学者根岸宽山(1979)等认为花生疮痂病有两种饱子类皇，为小里池子(34mX57m)和大型抱子(34mX1220m)；国内的张宝棣(1995)等、蔡学清(20(X)等则将花生疮加病分生胞子细分为3种类型，分别为长椭圆形(2.5-3.12mX12.5-15.6m)短椭圆形(2.52.75mx6.25-6.88Rn)和近圆形(2528m283Qwn)。作者仅在病斑上见到大量的椭圆形分生抱子，与根岸宽山描述的小型分生抱子形态大小一致，使用多种培养基及不

11、同培养条件均未见人工培养的病菌产抱，这符合痂圆也属其菌在培养战上难产刑获不产抱的特性（根岸宽山，1979：何胜强，1997：Atsushi.2009；Wani,1971）.花生疮摭病菌的产胞诱导与机理仍有待进一步的研究。由丁该病害为辽宁花生产区新流行性病害，研究历史较短，病害防治相关前期研究基础还相对薄弱，缺乏发生规律和预测预报技术研究，缺乏高效农药减依使用和无击化治理技术等研究工作基础，加之我省花生种植品种单一（白沙1016为主）、品种抗性差，花生种植户对该病害防控意识淡薄,识别能力和针对性药剂选择能力较差，至今花生疮痴病依然在辽宁各花生产区危害成灾。因此，开展田间病害调查和病原菌鉴定工作对

12、花生疮掘病潦行趋势预测、扩展动态、田间防治以及下一步开展病原菌侵染特性和致病机制的研尢具有重要的意义。第二节辽宁花生疮痂病菌表型和分子特性研究据作者2014-2015年病害调查发现，各花生产区由于天气持续干旱以及采取相应的防治措施，病害严重程度比2011年为所降低，但2011年之前未发生花生疮痂病的铁岭地区也陆续在各乡镇发生为击，病吉整体分布有向东、向北传播趋势。各花生产区病宙严重程度轻重不一，断芦岛、锦州和阜新地区病情相对较为严重，沈阳和昌图发病相对较轻，这可能是由于不同地区环境和栽培品种导致的病原菌种群内的遗传变异造成的(A1.varez.2003)。当环境条件适宜，高感作物大面积种植，病

13、原物会快速从个地区传播到另一个地区，造成病害大面积潦行(A1.icta1.,2014),病害每传播到一个新的地区，病原菌在新的外界生存压力可能会产生一定遗传变异来提高自身的生存能力(1.uoeta1.2007)。Hyun2(X)1)等在柑橘疮痂病菌表型时发现，病原菌菌落形态易变，即使同一株菌株在相I可的培养条件下也会出现不同的菌落形态.A1.vareznpeIinuiih分离自沈阳农业大学葡萄试脸园)，供试菌株来源见表26图2J0辽宁花生疮痂病分布情况(用点代表病害调查和样品采集地)Eig.2-10Distributionofpeanutscabdiseasein1.iaoning.(Dots

14、indicatetheareaswerethediseasewassun-eyedandsamp1.esco1.1.ected)表26供试菌株来源和菌丝生长速度Tab1.e2-6Originand1.ineargrwthoffunga1.usedin(hisstudy.序号NUnber曲株名称Dc4gna1.ion来源Ongin寄主Hos1.分自越位PMI落纹生长GrowthK1.xnfth空WkkhII.N5Y1辽宁省沈阳巾新旬JK实27.8426.5621.N-SY-AOI辽宁省沈阳市花生叶23.1622.8531.N-FT-AOI江宁省思新市花生茎18.2217.5841.NF1.BO3

15、辽宁竹章新巾花生茎25.1123.(第51.NFro3辽宁省阜新巾花生茎22.4521.8361.NFT-DOI辽宁省出新市花生叶21.9220.1471.N-FT-D02江字省期款市花生叶柄20X320.19B1.NTC-AO1.江宁省帙岭Itj花生茎225421.379.Ncno辽宁省铁岭市花生茎198519.68IO1.NTCC02辽宁省铁岭市花生茎23.5622.18I1.1.N-TC-DO1.辽宁留铁岭市花生叶20.9419.86121.N-JBA02辽宁省徐州巾花生茎233621.94131.NJHAo2辽宁省锦州巾花生茎24()323.05141.N-JH-BOI辽宁省德州市花生

16、叶22.1521.62151.N1.1.-A01辽宁省辽阳巾花生茎23.2122.95161.N1.1.-AOJ辽宁省辽阳市花生122.8921.91171.N1.1.-A(M辽宁省辽PHiP花生叶柄221421.96181.N-HX-AO!江于竹朝芦岛花生茎23.8222.76191.NHX-COI辽宁省葫芦岛花生茎24.9322.120ty-HXC02辽宁省葫芦岛花生茎239222.85211.N-HX-DOI辽宁省的芦岛花生叶23.1823.071.2 形态学和培养特性观察将供试菌株接种到到PDA上，每个菌株打取一个5mm的菌饼放置在PDA平板中央，每个处理3次重复，25C恒温光照培养3

17、0d,观察菌落颜色、气生菌丝的有无，并测量菌落直径。1.3 分子特性13.1 DNA提取培养510天的病原菌菌落,用做了挑取5个针尖大小的菌块,放入盛仃1.(X)m1.PD培养液(马铃薯200g,葡萄糖15g.水100Om1.)三角瓶内，置于摇床120rpm.25培养7丸收集菌丝并烘干，液氨研磨，按照天根DNA提取试剂盒(上海，TIANGEN)说明书提取病原菌基因组DNA.DNA片段用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDroP2000超微星分光光度计检测浓度与纯度，将DNA浓度调至20-50n1.3.2PeR扩增及测序以花生疮施病菌的DNA为模板，选择真菌核纳体基因转录间隔区(ITS)通用引物1TS

18、4/1TS5；28S区域通用引物1.RoR/1.R7：18S区域通用引物NS1/NS4。21个菌株ITS扩增片段送去金唯智生物公司进行测序，用MEGA7.()分析比对各菌株序列，用UPGMA法构建系统聚类树，1.SU和SSU基因的PCR产物用于PCR-RF1.P分析。13.2 PCR-RF1.P分析1.SU和SSU基因的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,紫外分析仪下检测不同菌株的PCR产物是否为特异性的单一条带0将PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(上海,生工)纯化，纯化后的PCR产物用于陶切.酶切体系1.)：IO1.PcR纯化产物，I1.限制性内切的(HindI1.kHinfkMs

19、p1.和Hae111,ThermoScientific),21.10BufferR.181.去RN的超纯水。将配置好的反应体系置于37。C水浴锅内曲解6h.得到的薄切产物IOJd与21.溟酚蓝(0.125%谀的蓝，40%蔗糖水溶液)混匀，经15%琼脂糖凝胶在8()V,40mA电泳条件卜电泳2h,凝胶置于紫外分析仪卜观察并照相。13.3 3RAPD分析从文献(A1.varczcta1.20002003；Hyuncta1.,2001；Wangcta1.,2009：POoIsawatcta1.2010)中获得的30条随机引物中筛选出7条多态性好,稳定性高,条带清晰的引物(见表2-7)用这I1.条引物

20、对花生疮痴病菌的总DNA进行扩机表2-7筛选获得的RAPD引物Tab1.e2-7PrinwrsofRAPDana1.ysisusedin(hestudy引物a号序列退火温度PrimerSequenceTnV0COPA-O1.CAGGCCCTTC41.0OPA-03GTCAGCCAC36.9OPA-07GAAACGGGTG36.9OPH-ISGacgccacac41.0S73Aagcctcgtc36.9S264CAGAAGCGGA36.9S484Agtgcgctga36.9RAPD-PCR反应体系(251.)：12.51.2TaqMasterMix.1.51.随机引物(10mmo1.1.),11

21、.DNA模板(30ngD,101.去RNA懒超纯水PCR扩增程序：94C预变性5min,94C变性Imin,35C退火Imin,72(延伸1.5min,4()个循环后，72*C延伸8min(PCR仪：S1.(KK)TMtherma1.cyc1.er.Bio-Rad1.aboratories.Inc.USA)。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶在8()丫电泳条件下电泳25h,凝胶置紫外分析仪下观察并照相以100bpDNAMakCr为标准，同一分子标记处电泳图谱清晰且可重史的条带赋值为T,弱带口不重匆或未出现带的赋值为“0”,形成1、()数据矩阵.用软件NTSYS-PC2.1Oe采用非加权组平均法(UP

22、CiMA)进行聚类分析，生成聚类S1.用软件POPGEN32对样品进行遗传参数分析。2结果与分析2.1 表型特性花生疮痂病菌菌落颜色多样，菌落颜色从红色、橘红色、黄褐色至白色，时长伴有气生菌纹(图2/1)。菌落培养过程中偶尔会发生扇形角变，角变区域般呈黑色或红色(图2-12),多数可稳定遗传.,AQB1.N-FT-B03菌丝生长速度最快，0.84nun/d,仍比葡萄黑痘病菌1.N-SY-I菌丝生长速度0.93mmd低（表2-6）。图2-14辽宁花生疮痴病的的落形态(PDA)Fig.2-!4Cu1.tura1.Chanic1.eristivsofS.arachidisonPDA2.2 分子特性2

23、.2.1 ITS序列分析20个花生疮痂病菌菌株的序列长度为610613bp,对照简荀黑痘病菌的序列长度为985bp,具有显著差异（图2-15）。基于ITS序列，用MEGA7.0通过非加权配刻算术平均法所构建的UPGMA系统聚类树图表明，19个花生疮痂病前聚在一支，表现出单系性，花生超施病菌株1.N-TCAO1.和其它19个菌株属于同生分支，同源性达97%.同属近缘种偷荀黑痘病菌1.N-SY-I能够很明显与花生疮痂病菌区分开（图2-16）.Bm1.ciefU1.NJBM21.fcjhaoj1.MHXCM1.NHXaM1.N-TC-AO1.IK-IC-Ott1.K-ICBO1.IJC-IC-DO1

24、.图221基于RAPD标记的21个样品UPGMA系统发育树Fig.2-21Phy1.ogeneticof21samp1.erusingtheUPGMAbasednRAPDUxhniquc3结论与讨论1.N-SY-11.NSVM1.DO1.IM.INH，g1.N1.1.Ao1.1.rf-1.1.-AW1.NJHM1.KHXD011.NHXA01对辽宁各花生产区疮痂病菌进行表型和分子特性研究，明确不同区域间病原菌种群遗传差异，可以更好的掌提病需的发生.发展动态，为抗病品种的选育和分布提供理论基础。本研究中花生疮痂病菌除了生长速度慢，肉质状隆起，表面有褶皱,气生菌丝不发达等菌落特征外，颜色呈现多种，

25、从淡黄色至红色，偶尔有棉架状或黑点状出现，这与痴Ia抱属真阈形态相符(根岸宽山，1979；Wani,2000；Sompong:2012).每一个物种均需要具符定的遗传多样性才能适应自然界的各种生存环境，从而持续存活下去Avise,1996).1.e(2012)等在研究越南中部花生白绢病菌的表型和基因多样性中，用ITS序列建立系统发育树，聘供试的103个花生白绢病菌株划分为3个群组，并发现不同群组的花牛.白绢病在形成菌核的数量和大小具有显著差异。本研究中由21个菌株的ITS序列构建的UPGMA树表明，花生疮痂病菌与其他同属近缘种葡荀黑痘病菌能够很明显区分开.而20个花生疮痂病菌间遗传差异较小，只

26、有采自铁岭的1.N-TC-AOI储株与其它菌株分开，但仍属于同一主分支。PCR-RF1.P分析结果表明，本文8个引物/施组合在花生疮痂病菌间无多态性条带，不能揭示花生.疮痂病菌的种群差异,可能需要下步选择更多的引物做组合进行更为系统的研究。RAPD分子标记可以较好的揭示辽宁花生疮痴病菌遗传多样性，利用该标记对21个加圆抱菌建立聚类分析树状图，结果表明，当遗传相似系数为0.79时，供试菌侏划分为5个遗传谱系，地理位置相近的花生疮痂病菌基本聚在了一起。试验结果表明辽宁省花生疮痂病菌亲绿关系较近,但存在定的遗传差异，其多样性与地域存在定的相关性。考虑到本研究样品群体仅限于辽宁花生主要产区，为获得该的

27、遗传差异的全面信息，有必要扩大菌株采集范图和数量，对河北、山东、江苏以及广东、广西进行花生疮痂病菌样品采集，进一步研究病菌的遗传多样性与地理来源之间的关系。而随着花生疮痂病菌遗传分化研究的不断深入，种群间遗传多样性与致病性之间的关系也应作为病苦研究的全点，为明确花生疮施病流行成灾机制以及病害的综合防控提供重要的理论依据。第三章辽宁花生品种对疮痂病的抗病性鉴定花生抢痂病在辽宁省届丁新潦行病害，分布范围广、发生危害重，严重制约者辽宁花生产业的持续发展。前期调杳发现，种植品种单一且无高抗品种是导致花生疮掘病发生危宙严重的主要原因之一(周如军，2013)。白沙1016是辽宁省主栽品种，种植年限较长，品

28、种混杂、老化、退化问题严重，抗病性差，农户自留种现象较为严重，多年的种植致使品种抗性降低，菌源数量增加，病害最终爆发式流行。利用抗病品种进行花生疮痴病的防治是当前病区生产上的迫切需求。方树民等(2007)采用病菌抱子悬浮液对福建主要花生品种进行了田间接种鉴定，认为主栽品种泉花10号对疮摭病抗性差，病菌潜育期短，产生病斑数多，释放他了量大，个生长李可多次反笑侵染，是导致福建花生疮痂病爆发流行的主婴因素.王正荣(2011)采用喷雾法对43个花生品种进行疮痂病抗性鉴定试验，发现中抗品种28个，抗病品种8个，这些品种可合理布局用来预防花生疮揄病。周如军等(2014)采用病回用自然诱发法对辽宁省18个花

29、生品种抗病性进行鉴定，发现中抗品种8个，未发现免疫和高抗品种,并认为辽宁省主栽花生品种白沙1016凤丁,感品种，是导致花生疮痂病流行成灾的主要因素。这些品种抗性鉴定表明，主栽品种抗病性差或品种布局不合理是导致花生疮痢病流行区域不断扩大和经常流行的主要原因。本文拟通过人工培养花生疮痂病菌定量接种田间花生，并进一步扩大进行抗疮痂病鉴定的花生品种数量，以期找到抗死痂病的花生品种，为辽宁省花生疮痂病的防治、抗病白种及栽培品种合理布局起到一定的借鉴作用。1材料与方法1.1 供试材料供试菌株采用花生疮痂病的1.N-SY-A01,供试花生品种共40个，分别为白沙1016、中白沙、大白沙、四粒红、白花生、鲁花

30、11、鲁花14、鲁花两粒红、阜花17、铁引花11、铁引花2号、锦花14、锦花15、黑花生、新花1号、新花2号、花育16、花育20、花育22、花自25、花白30、花育31、花育33、花白38、丰花I号、段花9414、海花1号、吨花1号、红花1号、农花5号、农花9号、农花”号、农花12号、农花13号、农花14号、农花15号、农花16号、农花18号、农花21号、农花23号均由沈阳农业大学植物病需流行学研究室提供。1.2 接种方法参照Chen等(25)和臧宪朋等(2010)的接种方法，步骤如F：用手术刀刮取黑暗培养30d的病原菌菌落，使用匀浆机(15(X)Or-min)匀浆3()60s,制成菌丝悬浮液

31、,测定菌丝悬浮液在60Onm波长下的吸光度，将OD6值定为1.52.0用电动喷壶将菌丝悬浮液均匀喷雾在出苗后30d的花生植株上，平均5m1.株、食袋保湿48h。1.3 试验区设置忒验田位于沈阳农业大学试验田，小区完全随机分布,保护行为白沙1016,小区面积为16nF,田史3次.1.4 调查方法侍的情梗定后（9月I1.日）采用五点取样法对各供试品种的发病情况进行调查，每点随机抽取10株，共50株，记录病害等级，计算病情指数，花生疮痂病分级标准参照方树民（2007）的方法，公式如下：病情指数=（各级级值X各级病株数）/（珀高级值X调查总株数）1（X）:相对抗病指数=1一某品种（系）病情指数/最感品种（系）病情指数。1.5 品种抗病性评价标准本研究以白沙1016为对照品种，根据相对抗病指数，对各品种的抗病性进行划分。免疫（I）：相对抗病指数为1.0：高抗（HR）：相对抗病指数为（）80-0.99:抗病（R）：相对抗病指数为060079:中抗（MR）：相对抗病指数为0.40059;感病（三）：相对抗病指数为Q200.39:高感（HS）：相对抗病指数为0.20以下。2结果与分析2.1抗病性鉴定结果供试的40个品种抗病性具有显著差别，但并