FXR、CYP7A1在妊娠期肝内胆汁淤积症孕鼠胆汁酸代谢中的作用.docx

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1、FXR.CYP7A1在妊娠期肝内胆汁淤积症孕鼠胆汁酸代谢中的作用EXR,CYP7A1在妊娠期肝内胆汁淤积症孕鼠胆汁酸代谢中的作用作者：兰易，刘建，邹姝丽，程浩，甘晓玲单位：重庆医科高校附属其次医院妇产科，重庆摘要：目的分析法尼醇受体(FXR)及其靶基因胆固醉7alpha;-羟化酶(CYP7A1)在妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahe-paticcholestasisofpregnancy,ICP)孕鼠肝脏的表达状况，探讨EXR与CYP71在ICP发病机制中的作用。方法用随机数字表法将30只孕15d的SD大鼠分成2组：生理盐水(NS)组和苯甲酸雌二醇(estradiolbenzoate,EB)组

2、，每组15只。用药前和用药后第5天分别测定血清中A1.T、AST、A1.P、TBA水平，同时视察肝脏形态学变更，并应用RT-BCK和Westernblot分别检测肝脏FXR、CYP71两者11RN和蛋白的表达。结果EB组用药后各血清生化指标比用药前显著上升(PltjObull;01),NS组用药前后无明显变更(Pgt;Obull;05);EB组孕鼠肝脏出现肝内胆汁淤积表现，NS组肝脏形态结构正常；EB组FXR和CYP7A1两者的mRNA和蛋白表达均显著高于NS组(Pit;Obull;01)0结论EB诱导的ICP孕鼠肝脏FXR及CYP7A1表达均增加,说明存在胆汁酸合成自身反馈调整障碍，导致胆汁

3、酸合成增加，这可能是ICP发病机制之一。关键词：孕鼠；胆汁淤积，肝内；法尼醉受体；胆固醉7alpha;-羟化随中图法分类号：R333.3;R34;R714.25文献标识码：AEffectsofFXRandCYP7A1onmctabolismofacidbileOfpregnantratswithintrahepaticCholestasis1.ANYi,1.IUJian,ZoUShu-Ii,CHENGHao,GANXiao-Iing(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheSecond.Affi1IatedHospitai,ChongqingMedical

4、university,Chongqing400010,China)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionsoffarnesoidXreceptor(FXR)anditstargetgenecholesterol-7alpha:-hydroxylase(CYP7l)in1iVerofprcgnantratswithi11trahepaticcholestasis,andtoexplorethemechanismofintrahepaticcholestasisOfpregnancy(ICP).MethodsThirtySDratsatgestat

5、ionday15WererandomlyassignedtoreceiveisotonicNachloride(NS)andestradiolbenzoate(EB)for5d.Blood(2ml)wastakenbeforeandattheendof5dayadministrationtomeasurethelevelsofA1.T,AST,A1.P,TBA,andthe1iVerofpregnantratsafterSacrificeweretakentoObservemorphologicchanges.ThemRNAandproteinex-pressionsofFXRandCYP71

6、in1iverweredeterminedbyRT-PCRandWesternblotting.ResultsTheserumlevelsofA1.T,AST,A1.P,TBAinEBratsincreasedsignificantly(Pit：ObulliOl),andthepathologicalchangesofEBratsprovedIntrahepaticcholestasis.ThcmRNAandproteinexpressionsofFXRandCYP71weresignifi-cantlyhigherinEBratsthanNSrats(Plt;Obull:01).Conclu

7、sionEstradiolbenzoateisthebestcandidateforin-ducingratmodelofICP.ThemRNAandproteinexpressionsofFXRandCYP7A1inIiverwereincreased,resultinginincreasedsynthesisofbileacids,whichmaybeoneofthemechanismsofICP.Keywords:pregnancyrat;cholestasis,intrahepatic：farnesoidXreceptor;cholestero-7alpha;-hydroxylase妊

8、娠期肝内胆汁淤积症(intrahepaticcholestasisOfpregnancy,1CP)是妊娠中晚期特发的肝脏疾病，其病因及发病机制至今尚未明确。国内外大量探讨表明该疾病的发生与胆汁酸的代谢亲密相关10本试验通过苯甲酸雌二醇(estradiolbenzoate,EB)诱导TCP模型，并用RT-PCR和Westernblot检测FXR及其靶基因CYP7A1的表达，并从胆汁酸合成Fl身反馈调整角度探讨两者在ICP发病机制中的作用。1材料与方法1.1材料EB注射液(上海通用药业公司)，羊抗大鼠FXR和CYP71多克隆抗体(SanIaCrUz),细胞核与细胞质蛋白抽提试剂盒(碧云天公司)，T

9、rizolRNA提取试剂(Invitrogcn公司)，RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)，引物由Invitrogen公司合成，口立7600全H动生化分析仪，GD-8型病理影像多媒体图文操作系统。1.2试验设计与方法1.2.1制备动物模型及分组清洁级SD雌鼠30只，体质量25(300g,鼠龄150180d,由本校试验动物中心供应。SD雌鼠在室温1828C,相对湿度40%70%的屏障系统内饲养，不限制饮水和饲料。在发情期按1:1与雄性大鼠合笼，每天视察阴栓脱落状况,阴栓脱落口定为妊娠第1天，始终饲养到妊娠15d,并用随机数字表法分成2组：生理盐水(NS)组和EB组，每组15只，分别赐予颈后皮下

10、注射NS(2.5mgbull：kg-lbull;d-l)和EB(2.5mgbulljkg-lbull;d-l),连续5d01.2.2标本采集及处理于用药前和用药后第5天分别采集心脏血2m,1用以测定A1.T、AST、A1.P、TB血清生化指标。用药完毕后，以拉断颈赣法处死母鼠，分别取肝脏组织3份，其中1份用于病理检测，另2份用于RT-PCR和Westernblot检测。1.2.3RT-PCR半定量检测肝组织FXR、CYP71mRN表达按TriZOIRNA提取试剂操作说明提取肝组织总RNA,应用逆转录试剂盒得到总cDNA。PCR引物序列为：FXR(283bp),上游5prime：-GACCACG

11、VGCCGTTGCT-3prime;,下游5prime;-TCTCCCT-GCCTCTCTATCCTT-3prime;CYP7A1(381bp),上游5prime;-GCTATTCT-CTGGGCATCTCAAG-Bprime;,下游5prime;-GAAAGTCAAAGGGTCTGGGT-AG-Sprime:;beta;-actin(600bp),上游5prime;-GCCCAGTCTGTTTGG-CC-3prime:,下游5prime;-GCAGTAATCTCCTTCTGCATCC-3Prime;。PCR反应条件：预变性94C2min,变性94,C30s,退火5930s,延长72rC30s

12、,共循环35次，延长72C5min,4C终止反应。反应后的扩增产物经隔琼脂糖凝胶电泳，并用QuantityOne软件对电泳结果进行分析，结果以目的基因条带与beta;-actin条带光密度的比值表示。1.2.4Westernblot半定量分析肝组织FXR和CYP71蛋白表达用细胞核与细胞质蛋白抽提试剂盒提取蛋白，用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，制备15%分别胶和5%积层脱上样，电泳后用电转移仪转移到PvDF膜上，封闭后加入羊多抗FXR和CYP7A1(1：100稀释)，分别以beta:-tublin和beta;-actin为内参照(1：400稀释)，4C孵育过夜，与辣根过氧化物前标记的二抗(1：20

13、00稀释)室温孵育1h,EC1.化学发光剂作用后在X光胶片上曝光、显影和定影，经QuantityOne软件分析光密度值，结果以目的蛋白条带与内参蛋白条带光密度的比值表示。1.3统计学处理数据以-XPIUSnin;S表示，采纳SPSS15.O统计软件，符合正态分布及方差齐性的参数采纳独立样本t检验进行2组间比较（除AST、TB外）,组内比较采纳配对t检验；不符合方差齐性的参数采纳Wilcoxon秩和检验（AST、TB）o2结果2.1血清生化指标变更用药前2组各生化指标无明显差异（Pgt；Obull;05）,用药后EB组各指标均显著高于NS组（Pit;Obull;01,表Do2.2孕鼠肝脏组织病理

14、学变更用药后，NS组的肝脏形态结构正常；EB组肝细胞肿胀，肝血窦变窄，少量肝细胞变性坏死,部分毛细胆管扩张且显影明显，可见部分毛细胆管内有胆栓形成。2.3FXR、CYP71mRNA表达的变更2.4FXR和CYP7lWestern蛋白印迹结果EB组肝脏FXR和CYP71蛋白的表达均强于NS组（Pit;Obull;01）,与RT-PCR结果相符（表2、图2）o3探讨ICP之所以引起国生医学界的高度重视，主要是ICP患者闹生儿发病率及病死率较高。探讨表明，胆汁酸中的主要毒性成分胆酸不仅能损伤母体肝细胞，还引起绒毛血管痉挛性收缩，从而导致胎儿宫内窘迫、羊水粪染、早产，甚至死胎、死产。母体胆汁酸水平的异

15、样上升与胎儿的预后亲密相关1,2,因此参加胆汁酸代谢的全部分子都可能成为ICP的病因。FXR是核受体超家族Hl亚家族中的成员（nrlh4）,FXR的生理功能是通过FXR/RXR二聚体结合到相应的DNA反应元件上，从而调整靶基因的表达来实现的3.FXR须通过胆酸调整才能够发挥其对靶基因的作用。多种人体内的生理性胆酸都能激活FXR,并促进其转录，其中尤以鹅脱氧胆酸作用最强。活化的FXR可启动一系列基因的转录活性，从而降低肝细胞内的胆汁酸浓度，而FXR最重要的生理功能是对胆酸生物合成的负反馈作用。CYP7A1是合成胆汁酸的限速瓶，FXR在胆汁酸的激活下，间接阻遏CYP71编码基因的转录，从而导致胆汁

16、酸生成削减4。对人类和啮鼠动物肝细胞体外探讨已经证明FXR通过调整CYP71的活性来调整胆汁酸合成5。然而在妊娠状态下，由于激素水平的显著变更，是否会影响这一反馈调整途径，国内外还缺乏相关探讨。本探讨运用EB处理后的孕鼠，血生化指标A1.T、AST、A1.P、TB均较比照组明显上升；其肝脏病理变更为肝细胞肿胀，肝血窦变窄，少量肝细胞变性坏死,部分毛细胆管扩张且显影明显，部分可见毛细胆管内有胆栓形成；两者均符合肝内胆汁淤积表现6,表明EB可以胜利诱导孕鼠肝内胆汁淤积模型的建立。本试验通过获得2组孕鼠肝脏组织，在基因转录和蛋白水平检测FXR与CYP7A1的表达，结果显示：EB组孕鼠肝脏FXRmRN

17、A和蛋白表达较比照组增加,但FXR表达的增加并未能抑制CYP71的表达，反而CYP7A1随FXR增加而增加。此结果表明：2组孕鼠肝脏存在FXR和CYP71的mRX及蛋白表达。EB组EXR表达增加，可以推想高浓度的胆酸能够增加FXR转录活性，旭酸对FXR表达存在着正反馈调整。EB组CYP71表达增加,说明在ICP孕鼠肝脏FXR未能实现其对CYP7A1的负反馈调整作用，故导致胆汁酸合成增加。分析其缘由可能是FXR是间接通过诱导转录抑制因子小分子异源二聚体伴侣(SHP)而发挥作用4,因此在胆汁酸合成反馈调整途径中还有另一个调整因子SHP对CYP7A1的表达发挥着重要的作用。有探讨表明，雌激素和雌激素

18、受体alpha：选择性激活剂可诱导SHP的表达，但它并不能抑制SHP靶基因CYP7A1的活性7,从而导致FXR对CYP71的负反馈调整障碍。综上所述，本试验结果表明：在NS组孕鼠，稍微增加的胆酸诱导了FXR的适量表达，从而抑制了CYP71的转录激活功能，使胆汁酸合成削减，实现胆汁酸合成的自我反馈调整；而在ICP时,血中高雌激素水平和高浓度胆酸诱导了肝脏FXR的大量表达，但大量表达的FXR并未能抑制CYP7A1的表达，CYP71表达增加，导致胆汁酸合成增加，当胆汁酸的大量合成超过肝脏的排泄实力时将引发胆汁淤积，该过程可能参加了妊娠期肝内胆汁淤积症的发生，尚待进一步探讨。参考文献：1张利平，刘建.

19、胆汁酸致妊娠肝内胆汁淤积症围产儿并发症的机制探讨U1.国际检验医学杂志，2007,28(4):355-357.2郭小娟.妊娠合并肝内胆汁淤积症的护理体会J.好用临床医药杂志，2007,11(12):64-66.3Huang1.,ZhaoA,1.ewJ1.,etal.FarnesoidXreceptoractivatestran-scriptionofthephospholipidpumpMDR3J.JBiolChem,2003,278(51):51085-51090.4BouliasK,KatrakiliN,BambergK,etal.Regulationofhepaticmeta-bo1ic

20、pathwaysbytheorphannuclearreceptorSHPJJ.EMBOJ,2005,24(14):2624-2633.5FiorucciS,ClericiC,AntonelliE,etal.Protectiveeffectsof6-ethylchcnodeoxycholicacid,afarnesoidXreceptorligand,inestrogen-inducedcholestasisJ.JPharmacolExpTher,2005,313(2):604-612.6葛环，徐昌芬，焦中秀，等.妊娠肝内胆汁淤积症动物模型的建立J.中华腹部疾病杂志，2003,3(3):157-160.71.aiK,HarnishDC,EvansMJ.Estrogenreceptoralpharegulatesex-pressionoftheorphanreceptorsmallheteroclimerpartnerJ.JBiolChem,2003,278(38):36418-36429.申明:本论文版权归原刊发杂志社全部，我们转载的目的是用于学术沟通与探讨，仅供参考不构成任何学术建议。