esVR-2在食管癌细胞中表达及其调控区3′UTR活性的研究.docx

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1、esVR-2在食管癌细胞中表达及其调控区3,UTR活性的探讨陈涛，索彩鼓，吴智勇，嚓连娣，谢剑君，吴健谊，姚晓冬，邹海鹰，王少洪，薛玉洁，许丽艳，李恩民(1.汕头高校医学院生物化学与分子生物学教研室，汕头，515041；2.汕头高校医学院肿瘤病理探讨室，汕头，515041：3.汕头市中心医院肿瘤科，汕头，515031；4.汕头市中心医院病理科，汕头，515041)摘要：目的检测内源性可溶性血管内皮生长因广受体2(endogenoussolublevascularendothelialgrowthfactorreceptor-2,esVR-2)在多种食管癌细胞中的表达状况，克隆esVR-2基因的

2、3-UTR,探讨esVR-2基因3UTR调控报告基因的活性。方法采纳逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)及定量逆转录聚合酷链反应法(qRT-PCR),检测esVR-2在多种食管癌细胞中的mRN的衣达水平；采纳3RACE法克隆esVR-2的3UTR区；采纳双荧光素酪报告基因分析系统，检测esVR-2基因3UTR区调控报告基因表达的实力。结果1)14种食管鳞癌细胞系中的9种，esVR-2的nRNA的表达水平明显低，占64.3%；2)两种食管腺癌细胞系SEGl和SKTG4,esVR-2的nRNA的表达水平，前者明显低，后者明显高:3)5种永生化食管上皮细胞，esVR-2的mRNA的表达水平均明显低：

3、4)与转染空载体PG1.-C的食管癌细胞相比，转染PG1.-C3UTR的食管癌细胞的报告基因荧光素前活性发生显著改变。结论1)永生化食管上皮细胞、多数食管鳞癌细胞和部分食管腺癌细胞，esVR-2的mRNA的表达水平明显低；2)esVR-2基因的3UTR具有调控报告基因表达的活性。关键词：内源性可溶性血管内皮生长因子受体2(esVR-2)：食管癌：调控区3UTR中图分类号:R446.8esVR-2在食管癌细胞中表达及其调控区3UTR活性的探讨#111,32113142251*10152025303540ExpressionofesVR-2inEsophagealSquamousCellCarci

4、nomaCell1.inesandActivityofIts3-UTRCHENTaol,SUOCai-ial,WUZhi-yongl,3,1.IAO1.ian-di2,XIEJian-junl,WUJian-yil,Y0Xiao-dong3,ZOUHai-yingl,WANGShao-hong4,XUEYu-jie2,XU1.i-yan2,1.IEn-minl(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041;2.Departmentofoncopatholog

5、y,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041;3.DepartmentofSurgicalOncology,TheShantouCentralHospital,Shantou515031：4.DepartmentofPathology,TheShantouCentralHospitai,Shantou515031)Abstract:Purpose:Theinvestigationistodetecttheexpressionofendogenoussolublevascularendothelialgrowthfactorreceptor2(e

6、sVR2)inesophagealsquamouscellcareinoma(ESCC),tocloneesVR23UTRandtoexplorethemechanismofregulation.Methods:DetectthemRNAexpressionlevelofesVR2usedReverseTranscriptiOn-PolymeraseChainReaction(RT-PCR)andquantifiedReverseTranscriptionPo1ymeraseChainReaction(qRT-PCR);cloned3UTRofesVR2use3RACE(RapidAmplif

7、icationofcDNEnds);usedDouble1.uciferaseReportGenetodetecttheregulationofesVR23UTR.Results:Ourresultsshowedthat:1)In14samplesofESCC,9ofesVR2mRNAshowalowexpression,thepercentagecomesto64.3%.2)ThelevelofmRNAofcsVR2inSEGlappearancesaremarkablelowexpression,whileSKTG4ishigh.3)TheexpressionsofesVR2mRNAare

8、alllowin5Immortalizedesophagealepithelialcells.4)ComparedwithonlytransfectPG1.-Cvectoraladenocarcinomacel1carcinoma(EACC)cellsandallImmortalizedesophagealepithelialcells,theexpressionofesVR2mRNAshowanobviouslowexpression：2)ThereisaregulationReportGeneactivityinesVR23UTR.Keywords:esVR-2(endogenoussol

9、ublevascularendothelialgrowthfactorreceptor-2);EsophagealCarcinoma;3UTR(3-untranslatedregion)455055可溶性血管内皮生长因子受体-2(endogenoussolublerecoptor-2,esVR-2),以往曾称之为可溶性血管内皮生长因子受体-2(solublevascularendthelialgrowthfactorreceptor-2)是一种分泌性蛋白，能够与血管内皮生长因子VEGF-C(vascular123管腺癌细胞系，以及5种永生化食管上皮细胞系进行了esVR-2的mRN的表达状况进行

10、了研究，与此同时，在克隆esVR-2基因3UTR的基础上，还检测了esVR-2基因3UTR调控报告基因表达的活性。60657075800引言内源性现报道如下。1材料与方法1.l细胞系、质粒与其它试剂食管鳞癌细胞系包括EC1.71、ECI8、EClO9、EC8712、EC9706.KYSE70.KYSE140.KYSEI50、KYSE180.KYSE510、SHEEC、TET、TE-3、COI.0680N,食管腺癌细胞系包括SEGl和SKTG4,永生化食管上皮细胞系包括NEl、NE2、NE3、NECO83、NEC6和SHEE,同时还有肾上皮细胞系293To质粒pESY-BluntSimple(p

11、ESY)购H北京TransGenBiotechnology公司，质粒pGEM-TVeCtOr购自Promega公司，质粒pG1.-C载体购FlPromega公司。TriZol试剂、199培育基、DMEM培育基、GibcoRPMI1640培育基、转染试剂AttraCteneTranSfeetionReagent购HQIAGEN公司。逆转录系统试剂盒(ReverseTranscriptionSystem)、PCRMix、双荧光素酶报告基因分析系统试剂盒(Dual-1.uciferaseReporterssaySystem)购自Promega公司，3RACE试剂盒(3-FullRACECoreSet

12、Ver.2.0)和TaKaRa1.ATaq及限制性内切酶购自TaKaRa公司，TransStartTaqDNPolymerase购自北京TransGenBiotechnology公司，质粒提取试剂盒(EndoFreeplasmidMiniprepKit)购自BIOMIG公司。1.2细胞培育全部细胞均置于37C、5%CO2、饱和湿度的培育箱中培育。食管鳞癌细胞EelO9、EC1.71、EC8712和SHEEC,贴壁生长于含10%灭活小牛血清的199培育液中：食管鳞癌细胞EC9706和食管腺癌细胞SEGl和SKTG4贴壁生长于含10%灭活小牛血清的DMEM培育液中：食管鳞癌-2-细胞KYSE系列和

13、永生化食管上皮细胞系，以及293T细胞贴壁生长于含10%灭活小牛血清的859095100105110115120DMEM培育液中。贴壁细胞培育成单层后，用0.25%的胰蛋白酶(含0.02%EDT)消化，传代培育，每3天传代一次，待达到(12)107数目后收获细胞，细胞密度为(1.01.5)106cells/ml.须要进行瞬时转染试验的细胞，接种子96孔培育板中，每孔1001,细胞接种密度为2105cells/ml,细胞置37C培育，细胞满度约80%90%时，转染质粒。1.3 逆转录聚合酶反应(RT-PCR)Trizol试剂提取细胞总RNA,经逆转录获得CDNA。用于RT-PCR扩增esVR2基

14、因的上下游引物分别是5-AGAGGAGAGAGGGTGATCTC-3和5-CAGAATTGTCTCCCTACCT-3；上游引物特异结合于VEGFR-2的第12和第13外显子，下游引物特异结合于VEGFR-2第13外显子末和第13内含子。RT-PCR的反应条件，95eC5min,950C15s,4830s,72,C30s,循环40次，72C5minPCRMix用于试验，产物长度393bpo1.4 定量逆转录聚合诙反应(qRT-PCR)用于(qRT-PCR)扩增esVR2基因部分序列的上下游引物分别为5-GCCTTGCTCAAGACAGGAG-3和5-CAACTGCCTCTGCACATG-3,上下

15、游分别特异性结合于VEGFR-2基因的第13外显子和第13内含子，扩增序列长104bpo扩增-Actin基因的上下游引物分别为5-CAACTGGGCGACATGGAGAA-3和5-GTAGCAACGTACATGGerGGG-3,上下游引物分别特异性结合于-Actin基因的第3和第4外显子,扩增序列长178bpOPCR反应体系101,反应条件，502min,950C10min,95,C15s,60C45s,循环45次；PCR反应3个平行。以-Actin基因为内参基因，以293T细胞为校准细胞，用2-CT法计算分析。1.5 3UTR的克隆与鉴定Trizol试剂提取食管鳞癌细胞TE-I的总RNA,用

16、3-Ful1RACECoreSetVer.2.0逆转录，在用试剂盒中的引物Inner-primer5-CCTATAGTGAATCACTAGTGGGGTCC-3及其他试剂与另外合成的引物esVR2-F7:5-GGTCCTGTGCGGGCGTTGGTGCCTT-3扩增3UTR,esVR2-F7结合于VEGFR2的原第13外显子和第13内含子,引物最终方框中的三个碱基为终止密码子。依据试剂盒供应的说明书逆转录，再用esVR2-F7和OUte1.Primer（试剂盒供应）及TaKaRa1.Taq进行温度梯度PCR扩增，最终esVR2-F7和Inner-primer进行PCR扩增，反应条件，95C3mi

17、n,954C30s,64.5*C30s,72*C3min,循环35次，72C5min。将PCR产物插入质粒pGEM-T后测序，最终将正确的目的片段亚克隆至质粒pCHECK-2o亚克隆的上下游引物分别为esVR-UF2:5YCTCTAGATGTAGTGCAAnCAGGTT和esVR2-UR2:5-GGCCGGCC11TTCTCCTTTCGTTT-3（斜体下划线分别是XbaI和FSeI位点，因为质粒PG1.-C载体上的多克隆位点这两个酶切位点）。亚克隆PCR反应条件，95C3min,95C20s,50,C30s,7220s,循环30次，72,C5min。采纳Xba1和Fse1双酣切鉴定重组质粒pG

18、1.-C3UTR,同时进行DNA测序分析。1.6 瞬时转染提取质粒并测定其含量。EndoFreeplasmidezFlowminikit（BIOMIG公司）提取质粒，并将试验质粒pG1.-C质粒和pG1.-C3UTR质粒稀释至200ngl,质粒pR1.-TK用作-3-pGEM-T-esVR2CO1.O68ONSHEECMarkerECl.71Marker内参。具体转染步骤参照AttracteneTransfectionReagent转染试剂操作手册进行。转染后48h,收获细胞。每组样品6个平行试验孔，并至少进行3次重夏试验。1.7 双荧光素醯报告基因检测与统计学分析125130135参照双荧光

19、素酶报告基因分析系统操作手册，在TD20/20照度计（TurnerDesigns公司）上进行双荧光素酶活性检测。依据TD20/20型照度计配置的软件包计算出各组转染细胞的相对荧光素酣活性（萤火虫荧光素酶/海肾荧光素胸），以此代表试验质粒上3UTR调控报告基因表达的活力。各组试验数据均计算平均值及标准差。应用SSPS13.0软件和GraphPadPrism5软件对各组试验数据之间的差异是否有统计学意义进行I检验。2结果2.1食管鳞癌细胞中esVR2的mRNA表达水平的检测RT-PCR扩增CSVR2基因片段的长度为393bp0电泳结果显示，随机挑取的细胞克隆SHEEC.ECl.71和COI.068

20、0N,均呈现特异性条带，条带的大小符合预期，阳性率为100%,详见图IAo扩增片段胜利连接到载体pGEM-T的试验结果见图1B。DN测序结果见图ICeqRT-PCR扩增esVR2基因片段的长度为104bp,扩增-Actin基因片段的长度为178bp以2-法进行定量PCR数据分析，以-Actin基因为内参照，对数值进行均一化处理；同时以细胞系293T作为相对正常的样本进行校正。结果显示14种食管嶙癌细胞系中的9种，esVR2基因的mRNA的表达水平明显低，占64.3%,结果见图2。500bp250bp500bpesVR2(393bp)AesVR2(393bp)B100bp140C图1esVR2基

21、因片段的克隆及测序比对结果APCR扩增esVR2片段BPCR鉴定esVR2片段C测序结果分析Fig.1CloningandsequencingofesVR2145EnquireesVR2fragmentusePCRBIdentifyesVR2fragmentusePCRCAnalyzetheresultofsequence-4-SHEECcolo680NKYSE150KYSE510KYSE180ECl.71HepG2EC18ECl09KYSE140SKGT4SEGl293TNECA6NE083SHEE293TNE3NElKYSE70EC8712EC9706293TTE-IesVR2esVR2e

22、sVR2相对表达量543210图2食管鳞癌细胞esVR2mRNA的表达Fig.2DetecttheexpressionofesVR2mRNwithqRT-PCRinEsophagcalSqUamoUScel1Carcinoma2.2食管腺癌细胞中esVR2的mRN表达水平的检测150用qRT-PCR检测两种食管腺癌细胞中CSYR2的mRNA表达水平，检测结果表明，Segl细胞esVR2基因mRNA的表达水平显著低，SKTG4细胞esVR2基因mRNA的表达水平明显高。详见图3。2.01.5相对表达量1.00.50.0155图3食管腺癌细胞中esVR2mRN的表达Fig.3DetectmRNAo

23、fesVR2expressioninesophagealadenocarcinomacelIs2.3永生化食管上皮细胞中esVR2的mRNA表达水平检测用qRT-PCR检测5种永生化食管上皮细胞esVR2的mRNA的表达水平，检测结果表明，5种受检细胞，esVR2基因mRN的表达水平均明显低，详见图4。1.51.00.5相对表达量0.0160图4永生化食管细胞中esVR2mRNA的表达Fig.4DetectmRNAofesVR2expressioninimmortalizedesophagealepithelialcelllines2.4esVR2基因3UTR的克隆与鉴定通过3RACE法扩增e

24、sVR2基因的3UTR,构建载体PGEM-T-3UTR,见图5。DNA测165序胜利，获得长度149bp的3UTR。亚克隆3UTR,获得重组质粒载体pG1.-C3UTRoXbaI和FseI施切鉴定结果显示，重组质粒载体所连的外源片段与预期一样，提示载体构建成功。-5-140UTR-3DNAmarkerMOUTR-I140UTR-2Relative1.uciferasectivity(100%)众所周知，癌细胞的局部淋巴结转移是恶性肿瘤的重要特征之一。对食管癌而言也一响着食管癌的治疗方式、复发和患者的远期生存等转移，特殊是微转移，由于没有找寻到合适的标记基因或蛋白，始终难以开展早期诊断预警。17

25、04Kb1Kb图5pG1.-C-3,UTR载体的构建Fig.5ConstructpG1.Cvectorwith3UTR2.5esVR2基因3UTR调控报告基因表达活性的检测以转染质粒PG1.-C细胞的相对荧光索酷活性(萤火虫荧光素酣/海肾荧光素酣)为1，报告基因活性的检测结果表明，转染PG1.-C3UTR至KYSE180.KYSE150和EC9706等食管鳞175癌细胞，其相对荧光素能的活性显著降低；而转染pGI,-C3UTR至TE3食管鳞癌细胞，其相对荧光素酶的活性不但未见显著降低，反而显著上升，详见图6,说明CSvR2基因的3UTR有调控报告基因表达的活性，但不同食管鳞癌细胞的表现有明显差

26、异，提示可能与这些细胞内环境中所存在的诸如某种miRNA等活性分子的不同有关。400300200*pG1.-CpG1.-C3,UTR100*0KYSE150KYSE180TE3EC9706180图6esVR2基因3UTR调控报告基因活性的检测Fig.6DetectactivityofesVR23,UTRregulationwithDouble1.uciferaseReportGone3探讨6样，以往大量的临床探讨证明，癌细胞的局部淋巴结转移是食管癌的重要临床问题，干脆影1857-9。然而长期以来，对食管癌的淋巴结这已经成为目前制约提高食管癌临床诊治效果和改善预后的瓶颈。而Sakai10和Har

27、ada11等人的探讨结果提示，人类基因组上可能的确存在着这样的基因，这些基因的扩增或缺失与食管癌的淋巴结转移亲密相关，有可能发展成为预警或指示食管癌淋巴结转移的分子标记190物。从组织病理学的层面上讲，食管癌的淋巴结转移主要是通过癌组织及其四周的淋巴管系统完成的。在食管癌组织中，特殊是癌组织浅表层淋巴管的生成是食管癌淋巴结转移的前提条件。与癌组织的血管生成须要肿痛血管生成促进因子的作用一样，癌组织的淋巴管生成同-6-促进食管癌淋巴管生成的作用或与食管癌淋巴结转移相关够结合VEGF-C,阻断VEGF-C的功能，抑制淋巴管的生成。以往曾有人一些恶性肿瘤，包括乳腺癌、结宜肠癌、神经母细胞瘤和黑色素瘤

28、等患者的血液循环中，伴未能把esVR-2基因的3UTR确定下来。我们从食管癌细胞中胜利克隆获得了一段长度为149bp的esVR-2基因的3UTR,双荧光素酶报告基因检测结果显示，esVR2基因的3UTR样离不开肿瘤淋巴管生成促进因子的作用。然而，迄今为止，由于探讨起步较晚，有关食管195癌淋巴管生成促进因子，始终少见探讨报道，目前被明确提出的只有VEGF-C,被证明具有12,13不过，检测食管癌患者血液中的VEGF-C用于预料食管癌淋巴结转移的精准性并不高：这示意着食管癌中可能还有其它因子，也同时参加了促食管癌的淋巴管生成及其淋巴结转移。而Harada等人11的探讨结果提示，人类基因组上的某些

29、基因可能编码食管癌淋巴结转移抑制因子，这些基因的缺失或低200表达可能会引发与VEGF-C高表达同样的病理效果，促进食管癌的淋巴管生成与淋巴结转移。这提示探讨解决食管癌的淋巴管生成与淋巴结转移问题，促进因子与抑制因子正反两个方面的作用都应当加以考虑。作为一种分泌性蛋白，esVR-2由血管内皮生长因子受体VEGFR-2(vascularCndOthelialgrowthfactorreceptor-2)编码基因的选择性剪接体表达，是VEGFR-2蛋白的截短型，能20512,14-16探讨发觉，在随着肿瘤的侵袭转移恶性进展，esVR2的表达水平显著下降。综合以上探讨，Mihaela等人17发表评述

30、性文章指出，作为一种重要的淋巴管生成新型抑制因子，在肿瘤中esVR2的表达下调有利于肿痛组织淋巴管的生成，促进肿痛的进一步恶性进展，促进癌细胞的淋巴结转移，210215220225230235而上调或激活esVR2表达的方法或化合物很可能被发展成为临床上防治某些恶性肿瘤的一种新的有效手段或药物。在本文中，我们检测了14种食管毓癌细胞系、2种食管腺癌细胞系和5种永生化食管上皮细胞系中esVR-2的mRN的表达水平。试验结果表明，14种食管鳞癌细胞系中的9种，2种食管腺癌细胞系中的1种，5种永生化食管上皮细胞系的全部，esVR-2的mRNA的表达水平明显低。这提示食管癌细胞中，esVR-2的mRN

31、A的表达水平的确在一部分的癌细胞中表现低下，与传统相识一样，但有相当的异质性,因此将检测esVR-2表达作为预警分子标记物的价值须要慎重评价，或许与其它分子标记物联合在一起，指示效果会更好。Albuquerque等人曾报道，esVR-2基因的3UTR有3个可能的PolyA信号位点，因此1在不同的食管癌细胞中，呈现对报告基因表达截然相反的调控活性，这或许与这些细胞内环境中所存在的诸如某种miRNA等活性分子的不同有关，具体状况尚有待进一步探讨。参考文献(References)11.AlbuqucrqueRJ,HayashiT,ChoWG,KleinmanME,DridiS,Takeda,Baff

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