广泛耐药肺炎克雷伯菌耐药表型分析及耐药机制研究.docx

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1、广泛耐药肺炎克雷伯菌耐药表型分析及耐药机制研究肺炎克雷伯菌是临床常见的机会致病菌，在免疫抑制及住院患者中，引发多种感染性疾病，包括呼吸系统感染、泌尿系统感染、血流感染等，继而延长住院时间，增加死亡率和医疗开支1,2O碳青霉烯类药物是治疗这类感染的重要抗菌药物，但近年来，碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKIebsieIIapneumoniae,CRKP)分离率逐渐上升，已占临床碳青霉烯耐药肠杆菌感染的70%90%3oCRKP对大部分B内酰胺类抗菌药物耐药，但部分CRKP同时也对其他多种非B内酰胺类抗菌药物耐药,如喳诺酮类和氨基糖首类4o这种对多类抗菌药物耐药，仅

2、对一两类抗菌药物敏感的肺炎克雷伯菌被称为广泛耐药肺炎克雷伯菌(extensiveIydrug-resistantKIebsieIIapneumoniae,XDRKP)5,6oXDRKP耐药谱多变，极大地限制了抗菌药物选择。细菌耐药表型的产生有多种原因，包括抗菌药物水解酶或抗菌药物耐药相关蛋白表达、抗菌药物作用靶位改变、细胞膜通透性降低、细菌外排泵激活等7。抗菌药物水解酶及抗菌药物耐药相关蛋白的表达是导致细菌耐药最主要且最常见的原因7o本研究收集山西白求恩医院2018年1月至2020年12月分离自临床样本的116株广泛耐药肺炎克雷伯菌，通过耐药表型筛选、药敏结果分析、PCR扩增相关耐药基因，研究

3、本地区XDRKP耐药特点和耐药基因的排列组合规律，以期为耐药基因流行趋势及相关耐药机制研究提供参考。材料与方法一、材料1.菌株来源：收集山西白求恩医院2018年1月至2020年12月分离的3201株肺炎克雷伯菌，结合临床资料综合判断各菌株是否为感染性疾病病原菌。判断标准为:有感染性症状(如发热、寒战、肌肉酸痛等)、存在明确的感染病灶或影像学改变、炎症标志物较平常升高2倍以上；按照美国临床和实验室标准化委员会(CliniCaland1.aboratoryStandardsInstitute,C1.SI)2020版8和欧洲药敏试验委员会9判读标准对各菌株已有药敏结果进行重新判读，筛选广泛耐药肺炎克

4、雷伯菌116株纳入研究。同一患者不同部位分离的XDRKP同时保留；同一患者同一部位多次分离的XDRKP,仅保留最后1株。分离自痰标本的菌株须保证标本合格(显微镜检：上皮细胞25每低倍视野)。所有研究对象均签署科研伦理知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会批准(YX1.1.-2019-76)o2.仪器与试剂：哥伦比亚血琼脂购自郑州AUTOBIo股份有限公司；M-H琼脂购自天津市金章科技发展有限公司；ASTGN16药敏卡购自法国Biomerieux有限公司；K-B法药敏纸片购自英国OXoid公司、替加环素微量肉汤稀释法药敏试剂购自温州康泰生物有限公司；各耐药基因PCR引物、2XSanTaqPCRM

5、iX预混液、DNA分子量标准(1002000bp)、50XTAEBUFFER均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；其他为常用试剂。微生物药敏分析仪(VlTEK-Compact2)、浓度比浊仪购自法国Biomerieux公司；基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(matrix-assistedIaserdesorption/ionizationtimeoffIightmassspectrometry,MA1.DI-TOFMS)微生物快速鉴定系统购自美国BrUkerDaltonics;PCR扩增仅购自德国艾本德有限公司；水平电泳装置购自美国MajOrSCienCe公司；凝胶成像系统购自珠海赛乐奇生

6、物技术有限公司。二、方法1.菌株鉴定和及药敏试验：入选菌株复苏后接种于哥伦比亚血琼脂，37C过夜培养，挑取对数生长期菌落进行细菌鉴定及药敏试验。细菌鉴定使用MA1.DI-TOFMS和VITEK-ComPaCt2完成。药敏试验使用VlTEK-COmPaCt2并ASTGN16药敏卡完成，药敏结果K-B法或微量肉汤稀释法复核。结果判读参考C1.Sl标准，替加环素判读参考欧洲药敏试验委员会标准。质控菌株ATCC25922、ATCeI705及ATCC1706由山西省临检中心提供。2 .碳青霉烯酶表型筛选试验：根据C1.SlMIOO-S288文件推荐方法，采用mCIM联合eCIM检测XDRKP碳青霉烯酶表

7、型，并与碳青霉烯酶基因扩增结果进行比对。3 .耐药基因检测：加热煮沸法提取细菌DNA作为模板，PCR扩增各耐药基因：碳青霉烯酶基因：blaKPGblaNDM、bIaVIM、blalMP和blaOXA;氨基糖普耐药基因：16SrRNA甲基化酶基因：rmtArmtCrmtDrmtG、rmtHarmA、npmArmtB、rmtE和rmtF,氨基聚糖甘修饰酶变体：aac(6,)-b-cr;喳诺酮耐药基因：DNA解旋酶保护蛋白qnr家族：qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS,外排泵蛋白：OqXAB、qepA,氨基聚糖普修饰酶变体：aac(6,)Tb-Cr;替加环素耐药Tet蛋白基因：外排泵蛋

8、白：tet(A)和tet(1.),核糖体保护蛋白：tet(M),替加环素修饰酶：tet(X)o各耐药基因具体引物序列及扩增条件见参考文献10,11,12,13,14,15,16,17。对扩增后样本行琼脂糖凝胶电泳(1.0%琼脂糖、IOoV、80A、30min)检测，根据条带位置初步判断有无阳性扩增产物及产物大小。将疑似阳性扩增产物送至北京赛默飞公司进行基因测序，测序结果与B1.AST程序内序列进行比对，对阳性扩增产物进行最终确认。4 .耐药表型与耐药基因型比对：将各菌株的耐药表型与基因型进行比对，分析各菌株耐药表型产生的可能原因。结果一、XDRKP基本临床信息20182020年共分离XDRKP

9、116株，总分离率3.62%(116/3201),其中113株分离自住院患者标本，占97.41%(113/116),3株分离自急诊科。耐药菌株主要分离于神经外科、重症监护室(ICU)和普通外科，分离率分别为：18.10%(21/116).16.38%(19/116).12.93%(15/116)。痰液及肺泡灌洗液、尿液、血液标本的XDRKP分离率分别为41.38%(48/116)、24.14%(28/116).10.34%(12/116),其他标本类型XDRKP分离率均低于10%o二、XDRKP药敏试验结果116株XDRKP中，头抱菌素和喳诺酮类抗菌药物耐药率均为100%(116/116)o碳

10、青霉烯类抗菌药物耐药率99.14%(115/116)、氨基糖甘类抗菌药物中庆大霉素耐药率96.55%(112/116)、妥布霉素耐药率94.83%(110/116),阿米卡星耐药率88.79%(103/116)。磺胺类抗菌药物复方磺胺甲嗯喳耐药率37.93%(44/116)o替加环素耐药率2.59%(3/116)o具体结果见表1。抗国药物类型药敏结果(株)耐药率(伙)敏感(S)中介(I)耐药(R)头抱菌素类a00116100破青霉烯类a1011599.14庆大霉素a41Ill95.69妥布褥索a5111094.83阿米卡星a13010388.79喔诺酮类a00116100复方横胺甲喀哩b675

11、4437.93昔加环素C104932.59注：aVITE国敏系统检测，K-B纸片扩散法复核，结果根据美国临床和实验室标准化委员会(QiniCaland1.abOratoryStandardsInstitute,C1.SI)2020版标准进行判读，二种结果无出入.b据2020版C1.Sl标准，复方3甲哇MlC值判读时无中介分类，但K-B纸片扩散法存在此区间(1115mm),该行所示为K-B法判读结果(所有“中介结果，其MlC值判读均为1敏索).CVITEK敏系统检测、微量肉汤箱窿法复核，结果根据欧洲药敏试验委员会(EuropeanCommitteeonAntimicrobialSusceptib

12、ilityTesting,EUCAST)标准进行判读.若两种判读结果不同，采用微量肉汤稀羟法判读结果为最雉果三、碳青霉烯酶表型筛选试验116株XDRKP中115株为CRKPomCIM联合eCIM检测碳青霉烯酶表型，结果显示丝氨酸酶阳性108株，检出率93.91%;金属酶阳性7株，阳性率为6.09%。与PCR结果比对：5株XDRKP同时携带bIaKPC和bIaNDM,此5株菌碳青霉烯酶表型为丝氨酸酶阳性金属酶阴性。另有3株XDRKP碳青霉烯酶表型为丝氨酸酶阳性金属酶阴性，但碳青霉烯酶耐药基因未检出。碳青霉烯酶表型筛选试验与碳青霉饰酶耐药基因扩增结果一致率为93.04%(107/115)o四、耐药

13、基因检测碳青霉烯耐药基因bIaKPC阳性率86.21%(100/116),bIaNDM阳性率6.03%(7/116)o5株XDRKP同时携带blaKPC和blaNDM,4株XDRKP未检出任何碳青霉烯酶基因。所有菌株未检出blaVIM、blalMP.bIaOXA;氨基糖甘耐药基因rmtB阳性率78.45%(91/116),armAFa性率O86%(1/116)、aac(6,)-b-cr阳性率259%(3116)。2株XDRKP同时携带armA和aac(6,)-b-cr,4株XDRKP同时携带rmtB和aac(6,)-b-cr,15株XDRKP未检出任何氨基糖甘类耐药基因。所有菌株未检出rmtA

14、rmtCrmtDrmtGrmtHnpmArmtErmtF;喳诺酮耐药基因OqXAB阳性率52.59%(61/116),qnrS阳性率5.17%(6/116),未检出单独携带qnrB及aac(6，1b-cr的XDRKPo16株XDRKP携带24种喳诺酮类耐药基因，33株XDRKP未检出喳诺酮耐药基因。所有菌株未检出qnrA、qnrCqnrS和qepA;替加环素耐药Tet蛋白基因tet(A)阳性率21.55%(25/116),所有菌株未检出tet(1.)、tet(M)和tet(X)o与其他3类抗菌药物耐药基因组合相比，喳诺酮耐药基因组合更加复杂且存在多种组合方式。qnrS+oxqAB(6/116)

15、与qnrB+oxqAB+aac(6,)-b-cr(4/116)是最常见的多基因组合方式。所有XDRKP未检出单独携带qnrB或aac(6)-b-cr,提示这两种基因可能与其他耐药基因共同存在介导喳诺酮耐药。基因扩增结果见表2,部分基因扩增产物电泳图见图1,2,3o表2各类抗菌药物耐药基因扩增结果耐药表型耐药基因阳性数阳性率()blaKPC186.21blaNDM76.03blaKPCblaNDM54.31阳性(-)43.45rmtB9178.45armA10.86氨基糖甘耐药aac)-Itxr32.59armA+aac(6,)-Ib-cr21.73rmtB+aac(6,)-Ib-43.45阳性

16、(-)1512.93OxqAB6152.59qnrS65.17qnrS+oxqAB65.17qnrS+aac(6,)-Itxr10.86唯诺耐耐药qnrB+oxqAB10.86oxqAB+aac(6r)-Ib-21.72qnrB+oxqAB+aac(6)-Ib-cr43.45qnrB+qnrS+oxqAB+aac(6,)-Ib-cr21.72阳性(-)3328.45曾力琳素耐1:5tet(A)2521.55阳性(-)9178.45bpM1234567891011121314151617500000900800700600500400300200100汪：M:100bpDNA;1-2:KCPWi

17、ftW;3:NDMlnt产4-5:KCPNDM!t产频泳：6*7:aA*W;89:rmtBTtF电泳：10:OxqABTtSTf也泳；11：qnrSThWmi*；12:QnrSexqABIriSf电冰：13:qfS*aac(6,)IkXflnS产物电泳：14:iroxqABittllffi泳；15:oxqAB*M(6)IbCrrerfcwi*;16:qf8*OxqAB*qnrS*)-Ibri*M1.i*:17：qrwBoxqAB*qnrS*aa(6,)-Ibcrt7*W图1琼脂糖凝胶电泳分离各耐药基因扩增产物bpM1234567891011121314151617181920212223242

18、0001000750500100250a：(BA.FO.E.q$.*A.AAC.A.E)rFM：100-2000bpDNAlW1-24Aqr.*8.AAC.A.qKqnrS及aac(6,)-b-cr耐药基因，提示XDRKP可以通过多种耐药基因介导耐药表型的产生。有趣的是，有33株XDRKP未检出任何喳诺酮耐药基因而耐药表型阳性，提示存在其他耐药机制，如作用靶位基因突变、抗菌药物摄入减少等。在耐药基因组合模式方面，喳诺酮耐药基因存在明显差异性：OqXAB、qnrS可以单独存在并介导XDRKP对于喳诺酮类抗菌药物的耐药，未发现单独携带qnrB、aac(6,)Tb-Cr的XDRKP,两种耐药基因通常

19、与oqxAB同时存在。这一发现也与Robicsek等20的报道相似，即aac(6,)-lb-cr通常仅能降低环丙沙星的活性，而对莫西沙星与左氧氟沙星无效，细菌往往同时携带其他耐药基因。另外，XDRKP可以携带14种喳诺酮类耐药基因，也提示可能存在耐药基因间的相互弥补作用或协同作用，需要进一步研究确认。替加环素被认为是治疗XDRKP的“最后屏障”3。表达tet相关蛋白是细菌替加环素耐药的原因之一，其中tet(A)与tet(1.)为外排泵蛋白、tet(M)是核糖体保护蛋白、tet(X)则是一种替加环素修饰酶16,17,21o本研究发现，tet(A)基因的检出率较替加环素耐药表型的发生率要高得多，很

20、多XDRKP携带有tet(A)而未产生耐药，说明单独携带tet(A)并不足以使细菌表现相关耐药表型，替加环素可以在一定程度上克服细菌tet(A)的影响。这也与田哲等22的报道类似，即替加环素可以在一定程度上克服tet(A)介导的外排泵作用22o同时也不排除不同菌株中tet(A)基因表达量及蛋白功能有所不同。另外，部分XDRKP替加环素耐药而tet耐药基因未检出，表明存在其他耐药机制，如ArCAB外排泵的过表达等。本研究还存在许多不足之处。首先，耐药机制的方法学研究尚不全面，没有对细菌可能的耐药机制进行全面研究。其次虽然在研究对象筛选时加入了炎症指标和影像学依据，仍不能完全排除部分XDRKP只是定植菌而非致病菌，导致研究结果可能存在一定偏差。最后，XDRKP包含多种耐药基因且排列组合形式各异，这些差异是否与细菌的MIC值高低及耐药表型有关，仍需要进一步研究。