平足蛋白（PDPN）在肝星状细胞活化以及肝纤维化中的作用分析.docx

《平足蛋白（PDPN）在肝星状细胞活化以及肝纤维化中的作用分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《平足蛋白（PDPN）在肝星状细胞活化以及肝纤维化中的作用分析.docx（6页珍藏版）》请在课桌文档上搜索。

1、肝纤维化及肝硬化DOI:10.12449/JCH240316平足蛋白(PDPN)在肝星状细胞活化以及肝纤维化中的作用分析三Q意。，杨广越”，张玮3浦幽,赵鑫”，马文婷小，刘旭凌邛，吴柳K,陶乐小,刘成Q上海中医药大学附属普陀医院a.肝病实验室，b.中心实验室，c.感染科，上海200062三三：文城,liucheng0082010163wm(ORCID:0000-0002-8741-6169)；陶乐，talent901036(g163.m(ORCID:0000-0002-3659-8134)摘要：目的探究平足蛋白(PDPN)在肝星状细胞活化以及肝纤维化中的作用，并对其机制进行初步探讨.方法收集2

2、019年9月2022年6月首次就诊于上海中医药大学附属普陀医院感染科的75例慢性乙型肝炎患者肝活检组织样本，实时定量PCR(RT-PCR)和免疫组化检测PDPN在不同肝纤维化分期患者肝组织中的表达.12只雄性C57/BL6小鼠随机分为正常组和模型组，每组各6只模型组腹腔注射含10%CCI4,对照组注射等体积橄榄;映6周，HE染色、天3B三红染色观察肝组织病理学变化，分离小鼠肝脏原代细胞，检测PDPNmRNA在各类型细胞中表达;使用PDPN蛋白处理小鼠原代肝星状细胞，并使用NF-KB抑制剂BAY11-7082处理,分析PDPN诱导肝星状细胞炎症因子表达情况o计量资料2组间骏采用成组1检验，多组间

3、比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-检验。两组数据相关性分析采用SPearman相关性分析法结果慢性乙型肝炎患者肝活检样本中，PDPNmRNA在正常肝脏中表达较低,S3、S4期肝组织中表达显著升高,与正常肝组织比较差异均有统计学意义(P值均0.001)；免疫组化染色结果显示，PDPN阳性表达主要集中在纤维间隔及肝窦，S4期肝组织PDPN口璀面积比SO期表达显著升高(f=8892,P=O.001)正常组小鼠中PDPN主要在肝嫁达少许,在Cd4侬小鼠中PDPN表班三高(f=0.95,P0.001),主三三F维间隔趣；RT-PCR结,PDPNmRNA在CCL蹴小鼠中显著升高(f=11.

4、25,P=Q.002).与肝细胞、肝星状细胞、Kupffer细胞和肝内胆管细胞相比，PDPN在肝要内皮细胞中明显高表达(F=20.56,P0.001);PDPN蛋白如型小鼠原代肝星状细胞15min,婶相关因子TNF-a、CCL3、CXCL1和CXCR1的mRNA表达，与对照组相比均显著升高(尸值均0.05),BAY11-7082(NF-KB信号抑制剂)处理后，上述炎跳标水平均明显下降(产值均005)结论在肝纤维化中主要表达在肝窦内皮细胞的PDPN增加，其通过NF-KB信号调节肝星状细胞活化，促进肝纤维化进展。关键词：肝纤维化；肝星状细胞；肝实内皮细胞；平足蛋白基金项目：自行将基金(20ZR14

5、50300)；国家自金(82004106)；区自主创惭项目(ptkwws202112,ptkwws202223)；上海市普陀区中心医院科研百人计划(2022-RCJC-02,2022-RCJC-04,2022-RCLH-01)；普陀杏林优青培养计划(ptxiyq2301)RoleofpodoplanininhepaticstellatecellactivationandliverfibrosisWANGZhiyPblYANGGUangy3,ZHANGWePlPUYaqiOn于,ZHAOXirrd,MAWentinc,LIUXUM及C,WULiifz,TAOL,c,LIUChery.(a.Lab

6、oratoryofLiverDiseases,b.CentralLaboratory,c.DepartmentOflnfectiousDiseases,PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062,China)Correspondingauthors:LIUCheng,Hucheng0082010(ORCID:0000-0002-8741-6169);TAOLe,talet901036(8)(ORCID:0000002-3659-8134)Abstract:Objec

7、tiveToinvestigatetheroleandmechanismofpodoplanin(PDPN)inhepaticstellatecell(HSC)activationandliverfibrosis.MethodsLiverbiopsysampleswerellectedfrom75patientswithchronichepatitisBwhoattendedDepartmentofInfectiousDiseases,PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,forthefi

8、rsttimefromSeptember2019toJune2022,andRT-PCRandimmunohisthemistrywereusedtomeasuretheexpressionofPDPNinlivertissueofpatientsindifferentstagesofliverfibrosis.Atotalof12maleC57BL6micewererandomlydividedintocontrolgroupandmodelgroup.Themiceinthemodelgroupweregivenintraperitonealejectionof10%Ca,andthose

9、intecontrolgroupwereinjectedwithanequalvolumeofoliveoil,for6weeks.HEstainingandSiriusRedstainingwereusedtoobserveliverhistopathologicalchanges;primarymouselivercellswereseparatedtomeasurethemRNAexpressionofPDPNinvarioustypesofcells;primarymouseHSCsweretreatedwithPDPNprotein,followedbytreatmentwithth

10、eNF-BinhibitorBAY11-7O8,tomeasuretheexpressionfinflammatoyfectorsinHSCsinducedbyPDPN.Teindependent-samplesftestwasusedforcomparisonofnonellydistributedcontinuousdatabetweentwogroups;aone-wayanalysisofvariancewasusedforcomparisbetweenmultiplegrps,andtheleastsignificantdifferenceMeStwasusedforfurtherc

11、omparisbetweentwogroups.TeSpearmancorrelationanalysiswasusedtoinvestigatedatacorrelation.ResuteAsfortheliverbiopsysamples,therewasarelativelylowmRNAexpnessilevelofPDPNinnormalliver,andtherewasasignificantineaseinthemRNAexpressilevelofPDPNinlivertissueofstageS3orS4fibrosis(allP0.001).ImmUnohistOChemi

12、CalstainingshelvedthatPDPNwasmainlyexpressedinthefibrousseptumandthehepaticsinusoid,andthePDPNpositiveareainS4livertissuewassignificantlyhigherthanthatinSOlivertissue(f=8,892,P=0,001).Innormalmice,PDPNwasmainlyexpressedinthehepaticsinusoid,andtherewasasignificantincreaseintheexpressionofPDPNinCamode

13、lmice(占0.95,PQ001),mainlyinthefibrousseptum.RT-PCRshowedasignificantincreaseinthemRNAexpressionofPDPNintheCQ1modelmice(UlL25,P=Oj002).Comparedwithhepatocytes,HSCs,Kupffercells,andbileductendothelialcells,hepaticsinusoidalendothelialcellsshewedasignificantlyhighexpressionlevelofPDPN(F=2056,P0,001).Co

14、mparedwiththecontrolgroup,theprimaymouseHSCstreatedbyPDPNproteinfor15minutesshowedsignificantineasesinthemRNAexpressionlevelsoftheinflammati-relatedfactorsTNFaiCCL3,CXCLl,andCXCRl(allP0.05),andthereweresignificantreductionsinthelevelsoftheseindicatorsaftertreatmentwithBAY11-7O82(allP:5-ACCGTGCCAGTGT

15、TGTTCTG3下游：S1-AGCACCTGTGGTTGTTAETGTaMouesTNFa:5-ATGAGAGGGAGGCCAEGa襁：5,-CAGCCTCCTCACCTGC-3,MouesCCL3百：5,-TGTACCATGACACTCTGCAAC-3,T:S-CAACGATGAATTGGCGTGGAA-3MouesCXCRli:5,-ACTGCTGTAAGAGCC11TGGG-3榜:5-AGCACCAGAATCACTAGGACA-3MouesCXCLl:5：ATCCGAAAATeTGTTGTGGC3榜：5,-C11TGCTATCITCCGCCAG-31.9统计学方法采用SPSS23.0软件

16、进行数据分析，计量资料以社S表示，2组间匕戢采用成组f检验;多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验。两组数据相关性分析采用Spearman相关性分析法。尸0.05为差异有统计学意义。2结果2.1 PDPN在肝纤维化患者肝组织中上调并与肝纤维化分期呈显著正相关慢性乙型肝炎患者肝活检HE染色表明：SO期肝组织正常，S4期肝组织纤维增生、炎性浸润明显（图la）。采用同患者的免疫组化检测PDPN表达，发现SO期肝组织PDPN表达呈弱阳性,S4期患者阳性分布于爆，雌显著升高g892,GO.001）（图1b）。为了进一步衡量PDPN表达与肝纤维化分期的关系，检测75例患者PDPN的mR

17、NA表达，结糠明，PDPNmRNA在正常肝脏中表达较氐,在S3、S4期肝脏中表达显著升高，与正常组比较差异均有统计学意义（P值均0OOl）（图Ic）o相关性分析结果表明，PDPNmRNA表达与肝纤维化分期显著正相关（UO.655,P0001）（图Id）。2.2 PDPN表达在肝纤维化小鼠肝组织中升高HE染色结果显示：正常组小鼠肝组织正常，小叶结构清晰，炎性浸润较少；模型组小鼠肝小叶中央静脉偏离，炎性浸润，脂肪变等病变o天狼星红染色结果显示：正常组小鼠组肝脏汇管区和中央静脉壁有少量胶原纤维着色，模型组小鼠肝组织见增生的胶原纤维分割肝小叶形成纤维间隔，部分假小0挪成（图2）。正常组PDPN阳性在肝

18、窦区表达相对较少，模型组20.0001(B)n三75r*0.65SAcOOOlPDPNERNA表达水平注：a,肝福HEaPDPN领到；b,PDPN阳崛厥计；c、d,PDPNmRNA与月TW七分蟒第.图1PDPN在临床肝活检样本中的表达Figure 1 TheexpressionofPDPNmRNAinliverbiopsytissueHE染色（XIOO）美独星红染色（XIOo）PDPN免疫蛆化（XlOO）PDPN电度蛆化（60O）注：红色箭头所指代表染色阳性位置.图2两组小鼠肝组织病理染色结果Figure 2 Thepathologicalstainingoflivertissueintwog

19、roups肝组织中PDPN在主要集中在纤维间隔，表达显著增加（P0.001）；提示肝纤维化进展中PDPN表达显著增加，在纤维间隔中表达增多（表2）。表2CCI,模型中PDPN及其mRNA表达分析Table2StatisticsofPDPNproteinandmRNAexpressionintwogroups指标正常组（n6）模型组（n=6）值P值PDPNmRNA1.000.269.791.7311.250.002PDPN(%)0.860.152.260.230.950.001无B三fe醐()0.570133.760393.040.0011 .3PDPN主要表达在LSEC为明确PDPN在肝脏中的

20、来源，分离了小鼠肝脏中各种类型的原代细胞，PT-PCR检测小鼠的肝细胞.LSECkHSCxKUPffer细胞和BEC中PDPN的表达0结果表明，PDPN在LSEC中表达最高（图3）。提示肝脏PDPN主要来源于LSEC。AO.00QJAc0.0l图3小鼠肝脏各类型细胞中PDPNmRNA相对表达Figure3RelativeexpressionofPDPNmRNAinvarioustypesofmouselivercells2 .4PDPN促进HSC活化相关通路PDPN（1ng/mL）处理原代小鼠HSC15min,RT-PCR检测炎症相关因子TNF-xCCL3、CXCLl和CXCRl的mRNA越，

21、可照组（PBS）相比，i指标均显著升高（尸值均0.05）,表明PDPN可促进HSC活化。BAY11-7082（NF-B信号抑制剂）处理后，上述炎症指标水平均明显下降（尸值均0.05）,表明在BAYlI-7082处理HSC后，PDPN的促炎症效果显著降低（表3）.3讨论肝纤维化是慢性肝损伤中的一个动态过程，各类慢性肝病和遗传相关疾病等均可导致肝纤维化l61其特征是细胞外基质增生与降解失衡，最终导致肝硬化m.活化的HSC是肝纤维化发生的细胞学基础，靶向HSC药物研究是目前的热点和难点，但尚未在人体研究中突显出疗效I8，这提示单方面将抗肝纤维化的研究聚焦在HSC上并不全面。1.SEC在维持肝内微循环

22、稳态中起着关键作用研究附发现LSEC与维持HSC静止和支持肝脏再生有关,但研究LSEC致肝纤维化报道较少oPDPN是一种黏蛋白跨膜蛋白EL最近研究L表明，PDPN在恶曲中瘤中高表达，如鳞状细胞癌、恶性间皮瘤，因此，PDPN也参与了肿瘤的形成和发展o另有研究I*J表明，PDPN在小鼠胆管结扎模型中表达升高，但PDPN参与肝纤维化进展的机制未见报道,本研究探讨了PDPN在HSC活化和肝纤维化中的作用。本研究发现，在慢性乙型肝炎患者肝组织中PDPN的表达随着肝纤维化分期的增加而升高，并且与肝纤维化分期呈显著正相关，提示PDPN与肝纤维化进展密切相关。通过小鼠肝纤维化模型分析显示，PDPN主要分布在肝

23、姿，主要在纤维间隔表达升高，再次酶PDPN与肝纤维化进展相关通过对人和小鼠肝脏原代细胞分析发现，与肝细胞、HSC.KUPffer细胞及BEC相睦，PDPN高表达于LSEC通过小鼠原代HSC发现，PDPN可显著诱导HSC炎症表达，提示PDPN可诱导HSC活化，而抑制NF-B信号，PDPN诱导HSC炎症产生的能力显著被抑制，提示PDPN通过NF-B诱导HSC活化促进肝纤维化进展。综h所述，肝纤维化进展中，PDPN显著升高，肝脏中表3小鼠原代HSC中炎症指标水平Table3ExpressionofinflammatoryinmouseprimaryHSC组别TNF-mRNACCL3mRNACXCL1

24、mRNACXCR1mRNAPBS+Veh组1.000.091.0.041.000.021.000.05PDPN+Veh组1.420.06)1.520.09,j2.030.111.890.03PBS+BAY11-7082组0.970.130.940.121.030.150.820.09PDPN+BA丫11-7082组0.860.052)0.900.082)0.990.022)1.040.212)F值24.4631.7485.9349.96P值0.0050.0050.0030.015注：BAY11-7082,NF-KB信号抑制剂.与PBS+Veh组比款,1)R0.05;与PDPN+Veh组比!交,

25、2)P0.05.PDPN主要来源于LSEC,肝损伤后来源于LSEC的PDPN诱导NF-KB信号诱导HSC活化，促进肝纤维化进展。伦理学声明：临床研究于2020年8月12日经由上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会审批，批号：PTEC-2020-32(Y)-1,符合临床研究伦理规范动物实验于2022年6月30日由上海中医药大学附属普陀医院实验动物伦理委员会审批，批号：QWEC-A-202206008,符合实验室动物管理与使用准则。利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。作者贡献声明：王知意、杨广越、张玮、赵鑫负责实验操作及资料分析，撰写论文；马文婷、刘旭凌、吴柳、浦娅琼参与收集数据，修改论文；刘成、

26、陶乐负责课题设计，指导撰写文章并最后定稿。参考文献：(1TAOLYANGG,SUNT.elal.CapsaicinreceptorTRPVImaintainsquiescenceofhepaticstellatecellsin(heliverviarecruitmentofSARMlUJ.JHepatol.2023.78(4):805-819.DOI:10.1016/j.jhep.2022.12.031.(2LIUXL.YANGGY.ZHANGW.ctal.TherapeuticeffectofTaohongSiwudecoctiononamousemodelofcarbonIecrachlo

27、ride-inducedliverfibrosisanditsmechanism(J.JClinHepatolt2021,37(11):2563-2568.DOI:10.3969j.issn.l001-5256.2021.l1.016.刘旭凌杨广越，张玮、等.桃红四物汤对CCL透导肝纤维化小鼠膜型的干预作用及其机制IJl,临床肝胆病杂志,2021.37(11):2563.2568.DOI:10.3969/j.issn.l001-5256.202l.l1.016.3FRIEDMANSL.PINZANIM.Hepaticfibrosis2022:Unmetneedsandablueprintfor

28、thefuure(J.Hepaiology,2022,75(2):473-488.DOI:IO.lOO2hcp.32285.4 4HUL.ZHANGP.SUNW.ctal.PDPNisaprognosticbiomarkcrandcorrelatedwithimmuneinfiltratingingastriccancerJ.Medicine(Baltimorc).2020.99(19):c9957.DOI:10.1097MD.000000000009957.5 5GRACIA-SANCHOJ.CAPARRSE,FERNANDEZlGLESlASA,eal.Roleofliversinusoi

29、dalendothelialcellsinliverdiseases)J.NatRcvGaSgenIeMlHepa,2021,18(6):411.431.DOI:10.i038s41575-020-00411-3.6)ZHAOXY.KONGYY.ZHAOXY.eal.Riskfactoranalysisofsignifi-cantliverfibrosisincheno-obesenon-alcoholicfa(tyliverdiseasepatientsJ.JClinExpMcd.2022.21(14):1497-1500.DOI:10.3969/j.issn.167h4695.2022.1

30、4.011.赵欣宇孔媛媛赵新颜.等.非肥胖型非酒精性8旨肪性肝病显著纤维化的影响因素分析J.临床和实验医学杂志,2022,21(14):1497-1500.DOI:10.3969j.tssn.l671.4695.2022.14.011.7JYANGGY.TAOL.ZHANGW.ctal.MechanismofactionofEupolyphagaSteleophagainimprovingnonalcoholicSteatohepaticisbyregulatingSyndCcan3(J.JClinHcpatol.2022.38(7):1513-1520.DOI:10.3969/j.issn.

31、1001-5256.2022.07.012.扬广越.陶乐,张玮，等.土翟虫调控林结合蛋白聚糖3改性非酒精性脂肪性肝炎的作用机制Jl,临床肝胆病杂志.2022.38(7):1513.1520.DOI:10.3969/j.issn.1001-5256.2022.07.012.8ROEHLENN,CROUCHETE.BaumertTP.LiVCrfibrosis:mcchanis-ticconceptsandtherapeuticpcrspcctivcs(J.Cells,2020.9(4):875.DOI:10.339WCem90408759DELEVELD.Liversinusoidalendot

32、helialcellsinhepaticfibrosisJ.Hepaiology.2015,61(5):1740-1746.DOI：10.1002hep.27376.110XIEG.WANGX.WANGL.cta).Rolcofdifferentiationofliversinu-soidalendothelialcellsinprogressionandregressionofhepaticfi-brosisinratsJ.Gastrocntcrology.2012,142(4):918-927.c6.DOI:10.1053j.gastro.2011.12.017.IIlIKRISHNANH

33、.OCHOA-ALVAREZJA.SHENY.ctal.Scrincsintheintracellulartailofpodoplanin(PDPN)regulatecellmotilityJ.JBiolChcm.2013,288(17):12215-12221.I:10.IO53j.gastro.2OI1.12.017.12WANGX.WANGX.L!J.ctal.PDPNcontributestoconstructingimmunosuppressivcmicroenvironmentinIDHwildlypcglioma(J.CancerGeneTher.202330(2):345.35

34、7.DOI:10.I038s4I417-022-00550-6.(131MRUYMAS.KONOH.FURUYAS.etal.Pltele(C-typeIeciin-Iikereceptor2reducescholestaticliverinjuryinmiccJ.AmJPathoL2020.190(9):1833.1842.DOI:10.1016/j.ajpaih.2020.05.009.收稿日期：2023-05-29；录用日期：2023-07-17本文编辑：刘晓红弓I证本文：WANGZY,YANGGY,ZHANGW,elal.Roleofpodoplanininhepaticstellatecellactivationandliverfibrosis(J.JClinHepatol,2024,40(3):533-538.王知意，杨广越、张玮，等.平足蛋白(PDPN)在肝里状细胞活化以及肝纤维化中的作用分析Jl.临床肝胆病杂志，2024,40(3):533-538.