化妆品光反应性活性氧（ROS）测定体外皮肤变态反应U937细胞激活.docx

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1、附件5光反应性活性氧（RoS）测定试验方法ReactiveOxygenSpecies（ROS）AssayforPhotoreactivity1范围本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧（ROS）测定试验的基本要求和方法。本方法适用于预测化妆品用化学原料的潜在光毒性。2试验目的预测化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。3定义下列术语和定义适用于本方法。3.1 光反应性Photoreactivity化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。3.2 光毒性Phototoxicity皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照

2、射下发生的类似反应。本方法所述光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒性。3.3 辐照度Irradiance照射到某一表面的紫外线或可见光的强度，单位为瓦每平方米（WAT?）或毫瓦每平方厘米（mWcm2）o3.4 光照剂量Doseoflight照射到某一表面的紫外线或可见光的量=强度X时间（秒）,单位为焦耳每平方米（J11?）或焦耳每平方厘米（cm2）。3.5 活性氧种类ReaCIiVeOXygenSPeCies,ROS活性氧种类，包括单线态氧和超氧阴离子。3.6 单线态氧SingletOxygen,SO由光辐照化学物质通过II型光化学反应产生的一种自由基。3.7 超氧阴离子Superoxide

3、Anion,SA由光辐照化学物质通过I型光化学反应产生的一种自由基。4试验原理一些具有光反应性的化学物质暴露于紫外线时，吸收某一波长光子，诱导发色团激发，激发能量转移到氧分子上，发生光化学反应，产生活性氧（包括单线态氟SO和超氧阴离子SA）,活性氧是光毒性反应中的重要中间物质。单线态氧和咪喋反应生成的过氧化物中间体对NN-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNo）具有漂白作用，使其在44Onm下的吸光度降低。超氧阴离子与氯化硝基四氮嘎蓝（NBT）反应生成NBT+,其在560nm波长下具有光吸收。本试验方法通过分光光度法测定化学物质经紫外线照射后对RNo在440nm下吸光度的减少及对NBT+在560nm下

4、吸光度的增加来判断该化学物质是否具有光反应性。5试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂应在配制后1个月内使用，并且在使用前应超声处理，以免物质析出、沉淀对试验造成影响。主要试剂配制方法如下：5.1 磷酸二氢钠。5.2 磷酸氢二钠。5.3 N,N二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）O5.4 咪嗖。5.5 氯化硝基四氮嘎蓝（NBT）。5.6 pH7.4的20mmol/L磷酸钠缓冲液（NaPB）称取593mgNaH2PO42H2O（CAS：13472-35-0）5.8gNa2HPO4-12H2O（CAS:10039-32-4）,加入约90O

5、mL水，混匀，用ImOlZL的HCI将PH值调节为7.4,定容至100omL后混匀。于2C8C冰箱或室温保存。5.7 0.2mmol/LN,N-二甲基4亚硝基苯胺（RNO,CAS：138-89-6）称取3mgRNO,溶于100mL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于2C8C冰箱避光保存。5.8 0.2mmol/L咪喋（CAS：288-32-4）称取13.6mg咪哇，溶于IOmL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀，得到20mmol/L咪嘎溶液。用20mmol/L的磷酸钠缓冲液将20mmol/L咪嘎溶液稀释100倍，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.9 0.4mmol/L氯化硝基

6、四氮噗蓝（NBT,CAS：298-83-9）称取32.7mgNBT,溶于IoomL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.10 溶剂的选择优先使用分析级二甲基亚碉（DMSO）对于不溶于DMSo的受试物，可使用20mmol/L的磷酸钠缓冲液作为溶剂。如果受试物在DMSo和磷酸钠缓冲液中不溶或不稳定，也可使用其他溶剂，但应保证受试物在所选溶剂中稳定，且参考化学物质的So值和SA值应在附录A规定的范围内。5.11 待测化学物质溶液的配制待测化学物质的分子量应是已知的。测试终浓度为200molL,如果在200molL浓度下的反应混合物有沉淀、着色或其他干扰等现象，则可以使用

7、20molL为终浓度进行测试。当待测化学物质在20molL的终浓度下得到阳性结果，表示该物质具有光反应性；但在浓度低于20molL下得到阴性结果，不能表示该物质无光反应性。待测化学物质溶液应现用现配，所有操作均应避免在强紫外线和强可见光照射（例如头顶灯下或在自然光暴露的窗户附近工作），以避免在试验前待测化学物质发生光激活或光降解。待测化学物质在试管中称重,加入5.10项溶剂，涡旋混匀，超声5-1Omin,配制成IommOl/L（终浓度200molL）。当终浓度200molL的反应混合物在光照前观察到沉淀、着色或其他干扰等现象时，需将IOmmoI/L的溶液用DMSO稀释成1mmol/L溶液（终浓

8、度20molL）。对于不溶于DMSo的化学物质，使用其他溶剂（如磷酸钠缓冲溶液）时，须使得反应混合物中含有20LDMSO（2%,vv）。5.12 阴性对照及阳性对照以奎宁盐酸盐二水合物（CAS：6119-47-7）作为阳性对照，以二苯甲酮4（CAS：4065-45-6）作为阴性对照。用DMSo按与受试物相同的方法将阳性对照和阴性对照配制成10mmol/L的储备溶液，分装后于.20冰箱冻存，于使用当天解冻，避免反复冻融，1个月内使用完毕。6仪器和设备6.1 太阳光模拟器6.1.1 选择合适的光源用于提供紫外线和可见光的照射，通过滤光片减少波长小于29Onm的UVC,使光源尽量接近室外日光。推荐的

9、测试条件如下：a） 配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线波长290nm）（见附录B）一辐照度：1.8mWcm2S2.2mWcm2,照射1小时（例如,AtlasSuntestCPS+的指标设置值为250Wm2）,一UVA光照剂量：6.5JZcm2至7.9JZcm2（见附录B）。b） 配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线波长30Onm）（见附录B）一辐照度：3.0mW/cn?至5.0mWZcm2,照射1小时（例如，SericSXL-2500V2）,一UVA光照剂量：UJc?至18Jc?（见附录B）。6.1.2 测试条件根据实际选择合适具体条件。6.1.3 ROS的产生受温度影响，太阳光模拟器应配备温度

10、控制装置，光照期间温度在2029。6.2 反应容器推荐使用石英反应容器（规格见附录C）,避免液体蒸发以及由于塑料盖造成的UV损失。也可使用其他UV透射率大于95%的盖子或密封件替代。实验室使用其他容器时，应使用附录A中的参考化学物质（序号1-17号）确定合适的仪器辐照度及光剂量。6.3 酶标仪。6.4 UVA紫外照度计。6.5 显微镜。7分析步骤7.1 将下列成分在避光条件下混合：7.1.1溶剂为DMSo的受试物:单线态氧SO超氧阴离子SA20mmol/LNaPB480L0.2mmol/L咪唾250L0.2mmol/LRNO250L10或1mmol/L受试物20L20mmol/LNaPB855

11、L0.4mmol/LNBT125LIo或1mmol/L受试物20L7.1.2溶剂为NaPB的受试物:单线态氧SO超氯阴离子SA20mmolLNaPB460L0.2mmol/L咪嘤250L0.2mmol/LRNO250LDMSO20L10或1mmol/L受试物20L20mmolLNaPB835L0.4mmol/LNBT125LDMSO20L10或1mmol/L受试物20L以20L溶剂替代受试物，作为空白对照。涡旋或超声510min后，将200L反应混合物加入到96孔板中，每组设置3个平行。96孔板加样详见附录D。7.2 在100倍显微镜下检查反应混合物中各组分溶解情况。如有沉淀、析出等现象，需降

12、低受试物浓度重新检测或停止检测。将96孔板震荡5s后，使用分光光度计或酶标仪测定光照前So检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。7.3 将96孔板置于石英反应器中，或盖上其他具有高UV透射率的盖子或密封件，置于太阳光模拟器中照射Iho记录光照前后的温度。7.4 完成光照后，将96孔板震荡1min,使用分光光度计或酶标仪测定光照后So检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。步骤流程图见附录E8分析结果表述8.1 SO值和SA值的计算计算受试物及对照品的So值和SA值，根据三个平行孔的数据计算平均值和标准偏差。1 .根据光照前后So测试孔在440n

13、m下的吸光度计算受试物的SO值SO值=440(一)-l44o(+)-(a-b)100O式中：A44o(一):光照前44Onm下的吸光度A44o(+):光照后44Onm下的吸光度a：光照前空白对照44Onm下的吸光度(平均值)b：光照后空白对照44Onm下的吸光度(平均值)2 .根据光照前后SA测试孔在560nm下的吸光度计算受试物的SA值SA值=560(+)-4560(一)-(b-a)1000式中：A56o(一):光照前56Onm下的吸光度As6o():光照后56Onm下的吸光度a：光照前空白对照56Onm下的吸光度(平均值)b：光照后空白对照56Onm下的吸光度(平均值)8.2 试验接受标准

14、试验应满足以下标准：1 .光照前，反应混合物中没有受试物沉淀。2 .光照前后，受试物对反应混合物没有颜色干扰。3 .试验过程中温度控制在20C29C范围内。4 .所有测试孔A440及A560应在0.021.5范围内。5 .应根据历史数据平均值2标准偏差建立实验室内阴性对照与阳性对照的质控范围。以下为根据验证数据得出的95%置信区间:200molL奎宁盐酸盐二水合物200molL二苯甲酮-4SO：319至583SA：193至385So：-9至11SA:20至28.3受试物的光反应性评判标准根据以下标准评判受试物的光反应性:分类样品浓度SOSAN25和270具有光反应性200molL70N25和7

15、0和/或有干扰具有弱光反应性200molL25和220,70具有光反应性20molLN25和N20无光反应性200molL25和80、90、100120、140、160、180、200o如果以上浓度无法测得受试物的70%细胞存活率浓度值（70%cellviability,CV70）,可以进行浓度调整。但受试物最终细胞接触浓度最高不超过200gmL;如果CD86的阳性值在1gmL,则对0.1gmL进行评估，以确认不会导致CD86超过阳性阈值的受试物的浓度；DMSO最终接触浓度不得超过0.4%。选择标准：至少2个浓度与前一次试验相同；确认非细胞毒性下的最高CD86阴性浓度;确认所有非细胞毒性CD8

16、6阳性浓度；确认最低细胞毒性浓度；在EC150（或最高阴性非细胞毒性浓度）和CV70（或溶解度评估允许的最高浓度）之间均匀选择其他所需浓度；若前两次运行有差异，尽可能选择多的共同浓度；若存在干扰，需重新选择阳性浓度。6.3 对照物处理培养基对照、溶剂对照（与受试物同法稀释）、阳性对照松香酸（DMSo溶解,最终浓度50gmL）、阴性对照LA（完全培养基溶解,最终浓度200gmL）,每种对照需要准备三对复孔。6.4 细胞铺板及染毒以3xl（）5个nL细胞传代培养2天或以1.5xl（）5个mL传代培养3天后，调整细胞浓度为5x105个mL,取100L孔受试物工作液和100L孔细胞悬液1:1混合接种于

17、96孔无菌平板中，每种条件下一对复孔，一孔用于CD86染色，一孔用于IgGl同型对照染色。每次CD86表达检测均需设置培养基对照、溶剂对照、阳性对照、阴性对照各三对复孔（当使用培养基作为溶剂时，溶剂对照与培养基相同），用密封带盖住板，在372%;,51%CO2,N95%湿度下培养孵育45h3h06.5 CD86表达检测孵育结束后，检查并确定溶解度（若在显微镜下观察到晶体或液滴，则会产生干扰）。用排枪将细胞吹两下从96孔平板对应移至V型板中，离心弃上清；用100L冰冷染色缓冲液清洗一次，然后在IooiJL染色缓冲液中重悬细胞；用7-AAD染色细胞（5L孔，1Omin室温，避光）；用100L冰冷染

18、色缓冲液清洗一次，然后在100lJL染色缓冲液中重新悬浮细胞；用FlTC标记的抗CD86或小鼠IgGl（5L孔，30min,4,避光）染色细胞；用100L冰冷染色缓冲液清洗两次；用100L冰冷PBS清洗一次；在冰冷PBS中再悬浮细胞(96孔板中100L或流式管中200L)。注意：整个染色操作应在冰上进行，在每一个洗涤步骤中，不要通过反复的移液来重悬细胞，而是在弃去上清液后通过短暂的涡旋来分散细胞即可。用流式细胞仪对每组细胞的细胞存活率及CD86阳性细胞百分比进行测定。分别用以下用公式计算出受试物的细胞存活率(CV70)和受试物的细胞刺激指数(S.L)oCV7O=C1+Vl-70(Vl-V2)

19、(C2-C1)VI：大于70%最小细胞活性值V2：小于70%最大细胞活性值Cl(gmL):Vl对应的受试物浓度C2(gmL):V2对应的受试物浓度C(受试组CD86+%受试组同型对照CD86+%)100一溶剂对照组CD86%溶剂对照组同型对照CD86,%CD86+%:CD86阳性细胞百分比6.6 流式细胞仪检测绘制SSC/FSC散点图，调节仪器电压，圈出U937细胞群PI门；绘制7-AAD直方图，圈出活细胞P2门；绘制FITC/SSC散点图，放置十字门，分析细胞表面标记物CD86的表达。通过获取完全培养基/IgGl孔表达值，设置FlTC/SSC十字门分析标记，以便在可能的情况下，所有三个或至少

20、两个完全培养基对照的IgGl位于0.6至0.9%区域内；如果这无法实现，则设置分析标记,使一个完全培养基对照的IgGl在0.6至0.9%,另一个完全培养基对照的IgGl在0.9%至1.5%；如果这仍然无法实现，则IgGl数据分布太广，必须放弃运行。之后在不移动分析标记的情况下，测量每个孔中IgGI阳性细胞或CD86阳性细胞的百分比。细胞显示在大小(FSC)和粒度(SSC)的散点图中，设置为对数比例(LOg),以便清楚地识别第一门RI门中的(population)细胞群和消除碎片。设置流式细胞仪，每孔获得Pl门细胞100oo个或包括死亡细胞在内的多达20,000个细胞,或在分析开始后1min内获

21、取数据。7结果评价7.1 试验成立条件7.1.1 完全培养基对照细胞平均存活率90%；至少两个完全培养基对照的IgGl0.6且90%；若丢弃一个DMSO对照的异常值后，剩下的两个DMSo对照的校正后的CD86表达值应高于或低于其平均值的25%；丢弃异常值后，DMSO溶剂对照CD86S.L的平均值小于250%。7.1.3 阳性对照三对复孔中至少两个为阳性(CD86S.I.150),必要时配制阳性对照系列浓度，应存在剂量反应。7.1.4 阴性对照三对复孔中至少有两个为阴性(CD86S.L150%),且细胞活性70%.7.1.5 溶解度干扰：受试物处理后453h(细胞染色前)在显微镜下观察到晶体或滴

22、状,则提示测试受到受试物溶解度干扰。7.1.6 颜色干扰：受试物FlTC标记IgGI散点图如发生位置偏移，则提示测试受到受试物颜色干扰(IgGI荧光通道几何平均数S.L150%)。7.2 致敏性结果判定每种受试物至少进行两次独立的CD86表达检测试验。每种受试物表达检测试验，如果CD86S.L仅在最高非细胞毒性浓度下高于150%,则在第一次试验中无法判定。每次表达检测试验，如果CD86S.I.在所有非细胞毒性浓度下低于150%,且无干扰(溶解度、颜色、细胞毒性)，则该次CD86表达判定为阴性；如I果CD86S.I.高于150%,不论有无剂量反应和/或干扰，则该次CD86表达均判定为阳性。如果两

23、次试验CD86表达结果一致，则可判定该受试物是否具有致敏性；如果两次试验CD86表达不具有一致性，则需进行第三次试验。如果第一次试验无法判定，第二次与第三次结果不致，则需进行第四次试验。最终的预测将基于三次或四次单独运行的结果来综合判定。7.3 有效作用浓度计算对于判定具有致敏性的物质，进一步计算其有效作用浓度值(EffeCIiVeConCenlration,EC),选用以下公式计算CD86的有效作用浓度值(ECI50)。EC15O=C1+I50-S.I.1(S.I.2-S.I.1)(C2-C1)5.1. kS.Ll50(EC150)最低刺激指数值5.2. 2:S.I.150(EC150)最低

24、刺激指数值Cl(gmL):S.L1对应的受试物浓度C2(gmL):S.I.2对应的受试物浓度8结果解释本试验结果能预测受试物的致敏性，可作为皮肤致敏性整合测试和评估方法(IATA)中的检测方法之一，这些结果在有限的范围内外推到人类。附件7皮肤吸收体内试验方法SkinAbsorption:inVivoMethod1范围本方法规定了化妆品原料皮肤吸收体内试验方法的术语和定义、试验原则、试验方法、试验数据和报告。本方法适用于化妆品原料经皮吸收的体内试验。本试验方法适用于单一成分的化妆品原料，非单一成分的原料若使用本方法进行评价，需要提供更多的科学依据说明其可行性。2试验目的本方法阐述了化妆品原料经皮

25、吸收的体内试验方法，以便为化妆品原料的毒性分类、标签标识和应用提供试验依据。3 定义3.1 未吸收剂量unabsorbeddose染毒后，从皮肤表面洗脱下来的和附着在遮盖装置上受试物的量，还包括在染毒过程中从皮肤表面挥发的量。3.2 吸收剂量（体内）absorbeddose（invivo）去除受试部位皮肤的受试物后，包括在尿液、笼具冲洗液、粪便、呼出气体（若有测试）、血液、各种组织（若有采集）以及保留在尸体中受试物的量。3.3 可吸收剂量absorbabledose皮肤冲洗后，存留在皮肤表面或皮肤组织内受试物的量。4 试验的基本原则受试物（最好用放射性同位素标记）施用于动物去毛的皮肤上，试验设

26、定具有代表性的一个或多个剂量组。在预定的染毒时间内，采用适宜的（非封闭、半封闭式或封闭式）遮盖装置覆盖染毒部位以防止动物舔舐试验样品，并让受试制备物与动物皮肤持续接触染毒一段时间。在染毒结束时，去除遮盖装置并用适宜的清洁剂清洗动物皮肤，保留用过的遮盖装置和清洗液以备分析测定，并换上新的遮盖装置。在染毒前、染毒期间和染毒结束后，试验动物均需在单独的代谢笼中饲养，并收集其排泄物和呼出气体以备分析测定。如果有充足的证据表明极少产生或不产生挥发性的放射性代谢产物，则可以不收集动物呼出气体。通常，每个剂量组内设几个动物试验组，一组在染毒结束后立即处死，其他组依次在预定时间间隔点处死。每一个采样时间点处死

27、的试验动物，对采集血样以及受试部位皮肤进行分析，并分析动物尸体以确定未被排泄的受试物的量。采集的样品以适当的方法进行分析，并对受试物经皮吸收的程度进行评估。5 试验方法5.1 受试物受试物是指被用于研究其渗透特性的物质。受试物最好用放射性同位素标记。制备的受试物（包括纯品、稀释品或者直接施用于皮肤的包含受试物的制备物）应与人体或者其他潜在目标种属可能的暴露形态一致（或是理想的替代物）；制备过程中出现任何不同于实际使用情形的改变必须有充分的理由。必要时，受试物可溶解或者悬浮于适当的溶媒中，对于非水性溶媒，应了解其吸收特性以及与受试物的潜在相互作用。5.2 实验动物和饲养环境5.2.1 动物物种、

28、品系的选择大鼠是最常用种属，但也可使用皮肤吸收速率与人类更相似的无毛系列动物品系。一般选用年轻成年健康的单性别动物（通常用雄性）。试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的士20%。如雄性大鼠的适宜体重为20Og250g,在该体重范围的上半区内更好。5.2.2 性别和数量通常，由单一性别的至少4只动物组成一个试验组，每个测试样品的每个预定观察终点需设一组。试验中的每个预定时间点处死一组动物，比如在染毒结束时间点（通常是6h或24h）和后续观察期结束时间点（例如48h和72h）。若已有资料表明受试物的经皮毒性存在明显的性别差异，则应选用更敏感的性别，否则可任选一种。5.2.3 饲养环境实验动物及

29、实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。试验期间（最好也包括试验之前的适应期）动物应在代谢笼中单笼饲养，尽量避免食物和水溢出容器影响试验结果。5.3 试验步骤5.3.1 试验动物的准备试验开始前，每只动物应做好标记加以区别，并在各自的笼具中至少饲养5天以适应实验环境。然后，在染毒前约24h,将每只动物肩部和背部局部皮肤去毛，并用丙酮轻轻擦拭皮肤表面以去除皮脂，因肥皂残留物有可能促进皮肤对测试物的吸收，故不推荐用肥皂水清洗皮肤。剃毛面积应足够大，以确保能可靠地计算出每平方厘米皮肤对受试物的吸收量，剃毛皮肤面积应该至少为IOCm2,该面积对于体重在20Og250g范围内的大鼠是

30、适宜的。动物准备完成后，重新放回代谢笼。5.3.2 皮肤染毒在皮肤表面确定特定面积的受试部位，将已知量的受试制备物均匀地涂抹于该部位。用量通常应采用人体可能的接触量，固体受试物通常为15mgcm2,液体受试物最多可达10LCm2。可根据受试物预期的使用情况、研究目的以及物理性质调整染毒剂量，但应有适当理由。染毒后，受试部位应避免被触碰。通常，受试部位应采用非闭合的遮盖装置覆盖（如透气尼龙纱布罩），典型装置的示例如图1所示。某些特定情况下，受试部位应采取闭合性保护。若半挥发性测试物质的挥发导致受试物的回收率超出可接受的范围（另见5.4）,应在受试物装置上覆盖活性炭过滤器以捕获挥发的受试物（见图1

31、）。任何覆盖装置都不应损伤皮肤，也不能吸收或与受试制备物发生反应。染毒后，将动物放回单独的代谢笼中以便收集排泄物。图1一种用于覆盖和保护受试部位皮肤的典型遮盖装置设计示例图5.3.3 染毒时间和取样染毒期是指在皮肤开始接触受试物，至清洗去除受试物之间的时间间隔。所采用的染毒时间（一般为6h或24h）应与通常人体可能的接触时间相对应。染毒结束后，将动物饲养于代谢笼中保留直至预定的处死时间点。染毒结束后，应对受试皮肤进行观察并记录任何可见的刺激症状。在整个研究过程中，应采用代谢笼分别收集尿液和粪便，并可在14C-标记的二氧化碳和挥发性14C化合物（5%）产生时进行收集和定量分析。尿液、粪便和捕获液

32、（如14C标记的二氧化碳和挥发性14C化合物）应在每个取样时间点从每组中单独收集。若有足够的资料证明很少或几乎不产生放射性代谢物，则可采用开放式笼架。整个试验期间，应定期观察动物的毒性或异常反应。染毒期，从开始皮肤接触后至24h以及随后的每一天，均应收集排泄物直至试验结束。一般而言，采集三个时间点的排泄物通常就足够了，但某些受试制备物的特征或现有动力学数据可能会要求有更适宜、或更多的收集时间点以便研究。染毒结束时，从每只动物身上移去保护装置并单独保留以便试验分析。所有动物的受试部位皮肤应用适宜的棉签蘸取清洗剂清洗至少3次，必须注意避免污染其他部位。清洗剂应为肥皂水等有代表性的常用卫生清洁剂。最

33、后,擦干皮肤，用新的干净遮盖装置覆盖受试部位皮肤，将这些动物放回代谢笼，作为后续时间点的实验动物组继续进行相关试验。必须保留所有擦洗棉签和洗液以供研究分析。5.3.4试验动物处理和检测对于每个实验组，应在预定时间处死试验动物，收集血样，移去保护性的装置或覆盖物并进行分析。剪下每只动物的受试部位皮肤以及对应的空白对照部位皮肤，分别进行试验分析。受试部位皮肤可分层，可将角质层与下面的真皮层分离，以提供受试物分布的更多信息。在染毒后的一段时间内，检测受试物的分布，将能提供该受试物在角质层中转运的某些指征。最后清洗皮肤并处死动物后，应移去保护性的覆盖物，以便于皮肤分层处理。从受试动物身体上环状切下受试

34、部位的皮肤并钉在板上，将黏附性胶条贴于皮肤表面，轻压，胶条将部分角质层粘附下来，继续用胶条重复粘贴，直到胶条不再粘附于皮肤表面，表明角质层已被全部去除。将同一只动物的所有胶条合并至一个单独的容器中，加入组织消化液溶解角质层。保留每只动物的尸体以便试验分析。在对动物尸体进行吸收剂量试验前，每个可能的靶组织均可被分离单独进行试验。一般而言，仅对尸体的总含量进行分析即可，若有其他研究提示，也可将靶组织分离进行单独试验。动物处死时，膀胱中的尿液应合并到先前收集的尿液中。此外，收集了代谢笼中的粪便后，笼子和捕获装置均应采用合适的溶剂冲洗并收集，其他潜在的受污染仪器也应该进行类似的处理。5.4 试验分析所有试验均应达到足够的回收率（如放射性标记物的回收率100%10%）,超出回收率范围的应说明理由。每个样品所使用的剂量应采用适宜、有效的方法进行分析。统计分析应考虑测定每个剂量组的平行样之间的偏差。6 数据和报告6.1 数据6.1.1 应对每只动物在每个取样时间点的受试物和（或）代