哺乳动物精子顶体反应检测方法研究进展.ppt
哺乳动物精子顶体反应检测方法研究进展,顶体反应是指获能精子在穿越卵丘细胞与透明带之前或穿透这些结构期间，精子被激活，在很短的时间内顶体要发生一系列变化，从而导致顶体内容物释放，以溶解卵丘细胞和透明带，进而穿过透明带与卵细胞融合完成受精的过程。,精子顶体反应,哺乳动物精子顶体是一个膜结合的帽状结构，它覆盖在精子核的前面。顶体由位于前面的顶体帽和位于后面的赤道板两部分组成。顶体的顶体隆起倒折形成顶脊，顶体的下部与精子原生质膜的加厚部分(核后帽)相连接。顶体外面有胞膜，位于胞膜下的是顶体外膜(OAM)，贴近核膜的是顶体内膜(IAM)。二膜之间的基质中含着精子完成受精过程所需要的水解酶和磷酸酯酶。,顶体帽,赤道板,OAM,IAM,精子顶体结构,顶体反应开始时，先是质膜与顶体外膜在多处位点融合，形成许多膜性囊泡和通道，然后脱离头部、破裂，顶体基质内的酶成份沿通道释放出来，暴露顶体内膜。,顶体反应的初始过程,精子顶体反应检测时，就精子存在的状态而言，可概括为两类检测。一种是固定检测，这就是必然杀死精子，经染色处理后在显微镜下观察。另一种是活体检测，即精子在存活的状态下进行顶体反应测定。活体检测精子顶体反应，不仅可以分析精子群体AR 态，而且可判断精子是强烈的活动还是弱的活动。,固体检测,活体检测,顶体反应检测,固体检测,原理：考马斯亮蓝是常用的蛋白质染色剂，顶体外膜含有大量的糖蛋白，可被染成紫蓝色。顶体反应后，精子顶体丢失，顶体区不着色。,优点：这种方法简便、经济，在多种哺乳动 物间具有推广性。,Moller和 Aarons等首先采用考马斯亮蓝染色法检测小鼠精子 AR。1999 年卓丹心等将此法推广到多种哺乳动物精子 AR的检测。同时，Larson也采用考马斯亮蓝染色法检测包括人、牛、猪、兔和小鼠等精子的 AR，并采用经典的荧光亲和技术 PSA法证明其可靠性。,方法：FITC（异硫氰酸荧光素）凝聚素染色(如 PSA)或 TRITC PSA 一步标记，甲醇固定处理30 s，用凝集素标 30 min。未发生 AR 的精子顶体结合 PSA 发出荧光，而AR 后的顶体则无荧光。,异硫氰酸荧光素分子式,主要表现为 4 种类型:整个精子都有荧光 死精子;顶体区有荧光 顶体完整精子;顶体区和顶体后区均无荧光 表示全顶体破 裂，是早已完成 AR 者;顶体后段和赤道段有荧光 表示刚发生 AR 不久，顶体内容物尚未完全丢失。,该技术与透射电镜 AR 技术高度相关，稳定可靠实用可行，一直沿用并成为其他新方法的标准对照。,原理：金霉素(chlortetracy2cline，CTC)是常用抗菌素之一，活精子或戊二醛固定后的精子均可结合 CTC 并发出较强荧光。它可根据精子不同的获能和 AR 阶段或精子表面差异进行染色。,CTC,“F”型为未获能精子，顶体帽完整，整个顶体布满黄绿色荧光,“B”型精子为已经获能精子，顶体依然存在，在顶体后区出现一条无或暗淡的荧光区带,“AR”型精子，顶体帽缺失，整个精子头部显示淡绿色或无荧光,近年来，CTC 技术越来越受到人们的青睐，已广泛应用于哺乳动物和人 AR 机理研究中。目前检测顶体反应的方法还有电镜观察法。这一方法可仔细地检查顶体状态，包括顶体反应。虽然透射电镜法评价精子顶体反应费力又费时，但它仍然是目前常用的经典技术。,活体检测,麝、豚鼠和仓鼠的顶体较大，用这种方法观察顶体反应更为有效。可根据顶体帽的存在与否比较容易评价活动精子的顶体反应。,冷却显微镜载物台,当精子活动的非常急剧时，可通过降低精子运动克服。例如:,减少盖玻片与载玻片之间的体积,将精子短暂的暴露于紫外线下制动精子。,悬浮于黏稠的培养基中,精子顶体反应期间释放的顶体酶类之一为酸性磷酸酶(ACP)，精子头浆膜及顶体外膜富含ACP活性。研究表明 ACP 检测为评价精子 AR 状态的一个有用指标。近年来，ACP 检测应用于人精子 AR。,与其它评价精子 AR 的方法相比，ACP 检测评价精子 AR 有 3 个优势:ACP 检测了在精子获能和 AR 反应中的 ACP，它代表了活精子群体的反应状态，介质中的 ACP 是从活精子和已发生 AR 的精子顶体释放的所有 ACP。2)此方法操作简便、经济实用，可同时检测多个样本，而且检测耗时少，且不需要特殊仪器设备。3)此法检测结果比较客观和稳定，ACP 检测不需要固定细胞，可避免一些通过光学显微镜确定 AR 的内在主观性。,双色法:使用 FITC PNA 并结合流式细胞仪检AR，能够提供精子顶体完整性的信息:顶体完整的精子没有荧光，顶体缺失或发生顶体反应的精子发绿色荧光。FITC PNA 与 PI 结合起来使评价精子的活力和顶体的完整性，对于新鲜的、体内获能的精子非常可靠。,三重染色技术:为了克服冷冻精液中蛋黄颗粒的影响，用 SYBR 14/PI 与藻红素(PE)花生凝集素的结合染料 PE PNA 来同时评价质膜的完整性和顶体的完整性，并结合流式细胞计数仪来检测，分析结果非常准确，还减少了洗去蛋黄颗粒带来的损伤和不便，是一种非常简单、实用的方法。此法将对哺乳动物精子的低温保存的研究有重要的意义,流式细胞仪检测精子的活力和顶体状态,绿箭头所指区域属于PI 标记精子，为死精子；蓝箭头所指代表FITC-PNA 标记精子，为顶体反应精子；黑箭头所指代表未发生顶体反应活精子。,A),H33342 标记所有精子细胞核呈现蓝色荧光；PI标记死精子的细胞核呈现红色荧光；发生顶体反应或顶体膜破损的精子被FITC-PNA 标记,呈现绿色顶体。,荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态,B),C),
