肾上腺素能受体阻滞剂普萘洛尔对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响.docx

肾上腺素能受体阻滞剂普蔡洛尔对骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响李锦琼I仝琳鸽2,李永萍I,张秋蓉'1 .大理大学第一附属医院血液科，云南大理6710002 .大理大学基础医学院生理学与病理生理学教研室，云南大理671000；【摘要】目的：研究肾上腺素能受体阻滞剂普蔡洛尔对人多发性骨髓瘤U266细胞珠增殖和凋亡的影响，探讨其在抑制多发性骨髓瘤中的潜在作用。方法：首先，收集大理大学第一附属医院2017年10月T2月14例初诊多发性骨髓瘤患者及5例健康发热患者骨髓病理标本作为病例组和对照组，应用免疫组化法分别检测两组骨髓样本中B2-AR的表达情况；其次，根据普蔡洛尔的浓度梯度，将96孔板中处于对数生长期的U266细胞分为1、10、20、50、100、200,400mol/L组，分别干预24h、48h和72h,对照组不加普蔡洛尔，利用CCK8法检测各组细胞的增殖活性，分析普蔡洛尔对U266细胞增殖的影响；另外，应用100,200molL普蔡洛尔分别干预对数生长期的U266细胞48h,对照组不加普蔡洛尔，RT-qPCR法检测U266细胞Bax、Bcl-2、CaSPaSe-3mRNA水平，用于分析普蔡洛尔对U266细胞凋亡的影响。结果：病例组和对照组骨髓组织中的浆细胞均表达B2-AR,其中病例组3例中等阳性(+，11例强阳性(+),对照组5例均弱阳性(+),病例组的表达显著高于对照组(Z=-3.65),差异有统计学意义(PSOJ):普蔡洛尔可显著抑制U266细胞增殖活性，抑制作用随药物作用时间的延长和浓度的增加而增强，差异均有统计学意义(PS05)：200mol/L普蔡洛尔组BCl-2、Bax、CaSpaSe-3的InRNA水平均显著高于对照组,分别为(2.93±0.31,1.00±0.11)、(6.37±0.24,1.00±0.03)和(2.44±0.71,1.00±0.06),差异有统计学意义(P<OlP<0.05),而100molL普蔡洛尔组仅有Bc2的mRNA水平显著高于对照组(2.94±0.6,1.00±0.11),差异有统计学意义(P<0.05)。结论：B2-AR在多发性骨髓瘤骨髓组织中表达升高，普蔡洛尔能抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖并促进其凋亡相关蛋白的转录，这可能是普蔡洛尔抗多发性骨髓瘤的相关作用机制之一。【关键词】多发性骨髓瘤；肾上腺素受体；普蔡洛尔；细胞增殖；细胞凋亡【中图分类号】：R551【文献标识码】：AEffectsofadrenergicreceptorblockerpropranololonproliferationandapoptosisofmyeloaongLiifLingeTonfYongpingLi1,QiurongZhang.7.DepartmentofHematologytFirstAffiliatedHospitalofDaliuniversity,YunnanDali,671000fChina;2,DepartmentofPhySiOIOgyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicine,Daliuniversity,YunnanDali,671000rChina【Abstract】Objective：Tostudytheeffectsofpropranolol,anadrenergicreceptorblocker,onproliferationandapoptosisofhumanmultiplemyelomaU266cellline,andtoexploreitspotentialroleininhibitingmultiplemyeloma.Methods：Firstly,bonemarrowpathologicalsamplesof14newlydiagnosedmultiplemyelomapatientsand5healthyfebrilepatientsfromtheFirstAffiliatedHospitalofDaliUniversitywerecollectedascasegroupandcontrolgroupfromOctobertoDecember2017.ImmunohiStochemistrywasusedtodetecttheexpressionof2ARinbonemarrowsamplesofthetwogroups.Secondly,accordingtotheconcentrationgradientofpropranolol,theU266cellsatlogarithmicgrowthstagein96-wellplateweredividedinto1,10,20,50,100,200and400mol/Lgroupsfor24h,48hand72h,respectively.Thecontrolgroupwasnotaddedpropranolol.TheproliferationactivityofcellsineachgroupwasdetectedbyCCK8method,whichusedtoanalysistheproliferationeffectsofpropranololontheU266cells.Inaddition,100mol/Lpropranololand200mol/LpropranololwereusedtointervenewithU266cellsatlogarithmicgrowthstagefor48h,andthecontrolgroupwasnotgivenpropranolol.ThemRNAlevelsofBax,BCI-2andCaspase-3inU266cellsweredetectedbyRTqPCRtoanalyzetheeffectofpropranololonapoptosisofU266cells.Results：TheplasmacellsofthebonemarrowtissuesofboththecasegroupandthecontrolgroupexpressedB2-AR,amongwhich3casesinthecasegroupweremoderatelypositive(+),11caseswerestronglypositive(+),and5casesinthecontrolgroupwereweaklypositive(+).TheexpressionofB2ARinthecasegroupwassignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup(Z=-3.65),thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).PropranololcouldsignificantlyinhibittheproliferationactivityofU266cells,andtheinhibitoryeffectwasincreasedwiththeextensionofdrugtreatmenttimeandtheincreaseofdrugconcentration,withstatisticalsignificance(P<0.05).ThemRNAlevelsofBcl-2,BaxandCaspase-3in200口mol/Lpi'opranololgroupweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup,whichwere(2.93÷0.31,L00±0.11),(6.37÷0.24,1.00÷0.03)and(2.44±0.71,1.00÷0.06),respectively.ThemRNAlevelofBci2in100mol/Lpropranololgroupwassignificantlyhigherthanthatincontrolgroup(2.94÷0.6,1.00±0.11,P<0.05),andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Conclusions:Theexpressionof2ARisincreasedinthebonemarrowtissueofmultiplemyeloma.Propranololcaninhibittheproliferationofmultiplemyelomacellsandpromotethetranscriptionofapoptosis-relatedproteins,whichmaybeoneoftherelatedmechanismsofpropranololagainstmultiplemyeloma.【Keywords】Multiplemyeloma；Adrenergicreceptor；Propranolol；Cellproliferation;Cellapoptosis多发性骨髓瘤(Multiploinyoloma,MM)是血液系统B淋巴细胞恶性增殖性疾病，发病率占血液系统肿瘤疾病的10%T5%,占所有恶性肿瘤死亡率的1%,目前仍然是一种不可治愈的疾病3。MM的主要发病机制是骨髓中浆细胞的异常克隆性增生，分泌大量单克隆免疫球蛋白，免疫球蛋白片段沉积或侵犯相应组织及器官，导致其器官及组织的损伤，引起骨质破坏、贫血、反任的感染、肾功能损伤等一系列临床表现。MM的发病率及死亡率呈逐年增高的趋势，其在个体间的自然病程有很大差异，从数月到超过数十年不等，治疗效果差异性大。因此对MM患者进行准确的病情和预后评估，选择有效的个体化化疗方案，对延长患者的生存时间具有重要意义。2肾上腺素能受体(B2-adrenergicreceptor,2-AR)广泛存在于心脏、骨髓、呼吸道等组织器官。研究表明B2-AR激活后能促进肿瘤转移、粘附、侵袭及转移，诱导肿痛细胞凋亡逃逸等"，而B2-AR阻滞剂能够抑制肿瘤细胞的增生、促进肿痛细胞凋亡、减弱肿瘤转移及浸润等"。细胞增箔和凋亡紊乱是肿瘤发生、发展的主要病理生理基础之一，B细胞淋巴痛因子2(BCI-2)、Bcl相关蛋白(BaX)是细胞凋亡的重要信号分子，可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CaSPaSe-3)、CaSPaSe-9,促进细胞凋亡ClL普蔡洛尔是一种非选择性B受体阻滞剂，临床上广泛应用于高血压和预防心绞痛等疾病的治疗，其是否能够通过抑制多发性骨髓痛组织中的B2-AR进而抑制骨髓瘤细胞的进展，目前尚不清楚。因此，本文通过检测MM骨髓组织中B2-AR的表达水平，研究普蔡洛尔对人多发性骨髓瘤细胞株U226增殖及凋亡的影响，探讨其在防治多发性骨髓瘤中的相关机制。1材料与方法1.1 材料来源选择2017年10月-12月大理大学第一附属医院收治的14例多发性骨髓瘤患者骨髓样本和同期5例健康发热患者骨髓样本（均经骨髓细胞学及病理组织学证实骨髓无异常）作为病例组和对照组两组患者的骨髓石蜡标本均从我院病理科档案库获取，所有患者完善骨髓穿刺及病理检查前均签署知情同意书。1.2 细胞系人多发性骨髓痛U266细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。在37、5%Ca悬浮培养于含10%胎牛血清、遇青链霉素混合液的RPMI-1640培养液中，细胞长满70%-80%时进行传代，取对数生长期细胞进行实验.1.3 主要试剂与仪器胎牛血清、RPMl-1640培养液（以色列Bl公司），普蔡洛尔（美国MedChemEXPreSS公司）美托洛尔（上海麦克林生化科技有限公司），CellCountingKit-8细胞增殖毒性检测试剂盒（日本DOjindo）,FastPureCel1/TissueTotalRNAIsolationKit、HiScriptIIQRTSuperMixforqPCR、ChamQuniversalSYBRqPCRMasterMix（美国VaZyme公司），Anti-beta2Adrenergic（美国AbCaln公司），新型快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（福州迈新生物技术开发有限公司）。5%C0:恒温培养箱（美国Thermo公司），酶标仪（奥地利安图斯公司），ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem（美国ABl公司），多功能照像光学显微镜（日本OlyinPUS公司）.1.4 骨髓瘤组织病理染色免疫组化法检测B2肾上腺素能受体，判断方法采用双盲法判定，由于骨髓组织细胞显微镜下难以观察，选用每张切片在显微镜下随机选择10个400倍视野,计数500个骨髓瘤细胞，以阳性细胞的百分率和细胞着色强度得分乘积进行结果判断。阳性细胞百分率计分：着色细胞占计数细胞百分率5%-0分,6%-25%f1分，26%-50%-2分，>50%-3分。着色强度计分：无色一0分，淡黄色一1分，黄色一2分，棕黄或棕褐色一3分。最终得分为上述二者的乘积:阴性（一）-0-1分,2-3分一弱阳性（+）,4-6分一中阳性（+）,>6分一强阳性（+）。1. 5CCK-8检测U266细胞增殖能力取对数生长期的U266细胞，调整细胞密度（5×10s/ml）按100RI/孔接种于96孔板培养箱中培养，加入不同浓度的普蔡洛尔（1、10、20,50、100,200、400mol/L）,对照组不加普蔡洛尔,分别培养I2h、24h、48h,按照CCK-8说明书每孔加入10NlCCK-8溶液，于培养箱内继续培养4h,酶标仪在450nm检测吸光度，重复3次，取平均值计算各组细胞增殖抑制率。1.6 凋亡相关mRNA表达量的RT-qPCR测定逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测BCI-2、Bax、CaSPaSe-3mRNA表达量。取对数生长期的U266细胞，调整细胞密度（5×105/ml）接种于6孔板培养箱中培养12h,根据CCK-8结果使用100pM、200HM普蔡洛尔对细胞干预48h,对照组不加普蔡洛尔，提取细胞总RNA,逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PT-qPCR,参照ChamQuniversalSYBRqPCRMasterMiX说明书配制PCR反应体系,引物序列见表1»表1qPCR引物序列Table1SequenceofqPCRprimersGeneSequenceCaspase3FOrWard5'-CAAATGGACCTGTTGACCTG-3',Reverse5'-ATGGCACAAAGCGACTGGATG-3'Bcl-2FOrWard5'-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3'Reverse5'-AGCCTGCAGCnTGTTTCAT-3'BaxFOrWard5'-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3*Reverse5'-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3'GAPDHFOrWard5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'Reverse5'-TTGAnnGGAGGGATCTCG-3'1.7 统计学方法所有数据都使用SPSS22.0和GraPhPadPriSm8软件处理。等级资料用非参数秩和检验。计量资料符合正态分布，以均数士标准差（x±s）表示，两独立样本均数比较采用独立样本t检验，多组计量资料均数比较采用单因素方差分析。以尸S05为差异有统计学意义。2结果2. 1两组患者骨髓组织的B2-AR表达水平比较B2-AR在对照组浆细胞和病例组瘤细胞中均有表达，两组骨髓组织中同时观察到中性粒细胞早期阶段均可见表达，晚期阶段粒细胞未见表达，红系均无表达。显微镜F观察到巨核细胞成强阳性表达，淋巴细胞则可见部分细胞的细胞膜有少量表达，差异具有统计学意义，Z=-3.65,P<0.01（见图1,表D。图1B2-AR在病例组瘤细胞和对照组浆细胞中的表达水平比较Figure1ComparisonofB2-ARexpressionlevelsintumorcellsandplasmacellsbetweencasegroupandcontrolgroup注：A,对照组骨髓组织浆细胞B2-AR表达(*400倍)；B,对照组骨髓组织HE染色(400倍)；C,多发性骨髓痛患者骨髓瘤细胞B2-AR表达(400倍)；D,发性骨髓瘤细胞HE染色(400倍)。Note:ATheexpressionofB2-ARinbonemarrowplasmacellsofcontrolgroup(×400);BHEstainingofbonemarrowtissuesincontrolgroup(×400);CTheexpressionof2-ARinmyelomacellsinmultiplemyelomapatients(×400);DHEstainingofprimarymyelomacells(×400).表1病例组瘤细胞和对照组浆细胞的B2-AR表达水平比较(14例)Table)ComparisonofB2-ARexpressionlevelsbetweencasegroupandcontrolgroup(14cases)组别例数B2-ARZ值P值-+-+病例组1400311-3.65<0.01对照组505002.2 普蔡洛尔对U266细胞增殖的抑制作用利用1、10、20、50、100、200、400mol/L的普蔡洛尔分别干预96孔板中处于对数生长期的U266细胞，对照组不加普蔡洛尔，选择24h、48h以及72小时三个时间点，分别比较普蔡洛尔干预组与对照组U266细胞抑制率水平。结果发现，与对照组相比，各实验组的细胞抑制率都降低，呈浓度和时间依赖性（见图2、表2：UPropranolol(M)袤8? Uoq-=3图2不同浓度普蔡洛尔对细胞抑制率的影响Figure2.Effectofdifferentconcentrationsofpropranololoncellinhibitionrate表2普蔡洛尔干预组在不同时间点细胞增殖抑制率的比较（n=3）Table2Comparisonofcellproliferationinhibitionrateinpropranololinterventiongroupatdifferenttimepoints(n=3)组别细胞增殖抑制率（%）24h48h72hIUM3.42±1.695.50±1.877.37土2.62IOuM3.44±1.356.01±2.216.33±2.6220UM5.85±1.637.08±1.0818.67±4.3350UM14.9±3,5115.84±3.3625.72土L32“100M28.64±2.93,35；47±6.60*51.07±L1.44200PM5L79±7.585.92±4.54*94.09±3.66"400M82.78±3.44"96.90±1.61*"98,57+2.43"注："*，、“*，和"*”表示，与对照组相比，普蔡洛尔干预组的细胞增值抑制率的差异具有统计学意义，分别为PV0.05、P<0.01fflP<0.001.Note:"*","*"and"*"indicatedthatcomparedwiththecontrolgroup,theinhibitoryrateofcellproliferationinthepropranololinterventiongroupwassignificantlydifferent,P<0.05,P<0.01andP<0.001,respectively.2.3 普蔡洛尔对U266细胞凋亡相关基因BCl-2、BaX及CaSPaSe-3mRNA表达水平的影响利用100、200Umol/L的普蔡洛尔分别干预对数生长期的U266细胞，对照组不加普蔡洛尔。结果发现，与对照组组相比，200UmOl/L普蔡洛尔干预组的BCI-2、BaX及CaSPaSe-3mRNA表达水平均明显增加，差异具有统计学意义，P<0.05.结果表明，普蔡洛尔能够促进Caspase3活化。此外，虽然干预组Bcl-2和Bax均升高，但200UmOl/L干预组的Bcl-2/Bax比值显著下降，差异具有统计学意义，P<0.05（见表3、图3）。A表2普蔡洛尔干预组与对照组BCI-2、Bax及Caspase-3mRNA表达水平的比较(n=3)Table2ComparisonofmRNAexpressionlevelsofBcl-2,BaxandCaspase-3betweenpropranololinterventiongroupandcontrolgroup(n=3)组别凋亡相关基因Bc12BaxCaspase3Bcl-2/BaxCon100UM200UM1.00+0.111.00±0.031.00+0.061.00+0.122.94+0.6w2.67±0.251.86±0.251.12+0.312.93±0.3"6.37±0.24E2.44±0.70.46÷0.06*注:、"*”和"*”表示，与对照组相比，普蔡洛尔干预组相关基因的表达的差异具有统计学意义,分别为PV0.05、P<0.0111P<0.OOUNote:”*",”*”and,'*indicatedthatcomparedwiththecontrolgroup,theexpressionofrelatedgenesinthepropranololinterventiongroupwassignificantlydifferent,P<0.05,P<0.01andP<0.001,respectively.图3普蔡洛尔干预组与对照组BCl-2、BaX及CaSPaSe-3InRNA表达水平的比较Figure2ComparisonofmRNAexpressionlevelsofBcl-2,BaxandCaspase-3betweenpropranololinterventiongroupandcontrolgroup注：A.各组BCI-2mRNA水平的比较；B.各组BaXmRNA水平的比较；C.各组CaSPaSe-3mRNA水平的比较；D.各组BCl-2/Bax比值的比较。"*”、"*”和"*”表示的意义表2相同。Note:A.ComparisonofBcl-2mRNAlevelsineachgroup;B.ComparisonofBaxmRNAlevelsamongallgroups;C.ComparisonofCaspase-3mRNAlevelsineachgroup;D.ComparisonofBcl-2Baxratioamongallgroups.Themeaningsof,*r,*5fs"and,*,rarethesameinTable2.3讨论多发性骨髓瘤是一种克隆性浆细胞恶性肿瘤，以骨髓内外浆细胞的无序增殖为主要特征，其发病机制复杂，至今尚不完全清楚。近年来，基于流行病学的研究发现了机体在长期应激环境下能够促进肿瘤的发生发展。其中的机制可能为机体的交感神经在应激环境下分泌过量的儿茶酚胺类物质，这揭示了神经传递信号与肿瘤的关系。在体外实验中，儿茶酚胺类物质能够促进多种类型肿瘤细胞的增殖、转移，并发现儿茶酚胺-B肾上腺素能受体介导的信号转导通路在肿瘤发生发展中起关键作用"旬.B肾上腺素能受体包括三种亚型，B1-AR,B2-AR和B3-AR,广泛分布于全身各组织器官，在调节机体心脏功能、血压、代谢等活动中发挥重要作用。此外，在多种肿瘤组织中发现了过量表达的B肾上腺素能受体，以B2-AR为主，表明其与肿瘤密切相关"L本研究通过检测多发现骨髓及对照组患者骨髓中B2-AR的表达水平，发现B2-AR在两组患者骨髓组织中均表达，而多发性骨髓瘤患者骨髓组织中的B2-AR表达水平显著升高。该结果表明，B2-AR的表达升高可能与多发性骨髓瘤的发生发展密切相关。多发性骨髓瘤的治疗是当前临床面临的重要挑战之一，开发副作用小、缓解效率高的新药是该领域的重要方向.普蔡洛尔是一种非选择性B肾上腺素能受体阻滞剂，能够有效阻断儿茶酚肢类物质和神经递质B受体的激动作用，该药物的安全性和经济性良好，毒副作用小，临床上广泛用于心血管疾病的治疗。近年来的研究表明，普蔡洛尔在肿瘤的治疗中具有良好应用前景3".本研究在体外探讨了普蔡洛尔对多发性骨髓瘤细胞株U266增殖和凋亡的影响，发现普蔡洛尔能够抑制骨髓瘤细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性；同时普蔡洛尔干预多发性骨髓瘤细胞后,该细胞中的凋亡信号通路标志物BCl-2、BaX及CaSPaSe-3的DlRNA水平显著升高，表明普蔡洛尔通过抑制B肾上腺素能受体能够激活细胞中的凋亡信号通路，可能促进细胞的凋亡。综上所述，本研究证实了B2-AR在多发性骨髓瘤患者骨髓组织中表达显著升高，证实了B2-AR可能与多发性骨髓瘤具有密切相关性；同时在体外实验中发现，肾上腺素能受体抑制剂普蔡洛尔能够抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，并能促进该细胞凋亡通路关犍性标志物的mRNA表达升高，提示普蔡洛尔可能在抑制多发性骨髓瘤中具有重要作用。该研究初步揭示了B2肾上腺素受体与多发性骨髓瘤的关系，可能为多发性骨髓瘤的发病机制及治疗方法提供新途径。【参考文献】1 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