过氧化物酶PeroxidasePOD试剂盒说明书.docx

过氧化物酶(PeroXidase,POD)试剂盒说明书微法100*/96样注意，正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义，POD(EC1.11.1.7)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过l化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。刑定原理：POD催化HiO:氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/旅标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸憎水试剂的组成：提取液：液体100mLxl瓶，4C保存；试剂一：液体25mLx瓶，4.C保存；试剂二：液体100L×l支，4C保存；试剂三：液体100Lxl支，4C保存。粗液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(IO4个)：提取液体积(mL)为5OO1(X)O:1的比例(建议500万细菌或细胞加入ImL提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,In复30次)；8000g4七离心IOmin,取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量(g)：提取液体枳(mL)为1：5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g4P离心IOmin,取上清，置冰上待测.2、血清(浆)样品：直接检测.测定步9L1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至470nm,蒸情水调零。2、工作液的配制：临用前将试剂一、试剂二、试剂三按照2.6(mL)：1.5(L):1(L)的比例混匀；在37.C(哺乳动物)或25寸(其它物种)预热IOmin以上；现配现用。3、在微量石英比色皿或96孔板中加入IOHL样本和190L工作液，混匀，记录47OnmFlmin时吸光值AI和2min后的吸光值A2。计算AA=A2-A1<,注意I如果AA小于0.005,可将反应时间延长到5min。如果AA大于0.5,可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀择倍数。POD活性计算:用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清（浆）POD活性单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。计算公式：POD<UmL）=AAXV反总÷V样÷0.01÷T=2000><AA2、组织、细菌或细胞PoD活性（1）按样本蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。POD<Umgprot）=AAXV反总÷（V样XCPr）÷0.01÷T=2000×A÷Cpr（2）按样本鲜重计算单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。POD<Ug鲜重）=AAXV反总÷（WxV样÷V样总）÷0.01÷T=2000><AA+W（3）按细菌或细胞密度计算单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。POD<U104cell）=A><V反总*50OXV样÷V样总）÷0.01÷T=4AV反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.01mL：V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，Imin；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL:W：样本殖量：500：细菌或细胞总数，500万。用96孔板测定的计算公式如下1、血清（浆）PoD活性单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A470变化0.005为一个酶活力单位。POD<UmL）=AAXV反总÷V样÷0.005+T=4000*A2、组织、细菌或细胞PoD活性（1）按样本蛋Iil浓度计算单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.5为一个酶活力单位。POD（U/mgprot）=AAXV反总+（V样XCPr）÷0.005÷T=4000×A÷Cpr<2）按样本鲜重计算单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A470变化0.5为一个酶活力单位。POD<Ug鲜重）=AAXV反总+（WXV样+V样总H<）.005+T=4000AA+W（3）按细菌或细胞密度计算单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A470变化0.005为一个i活力单位。POD<U104cell）=AAXV反总+（50OXV样+V样总）+0.005+T=8AAV反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，Imin；Cpr：样本蛋Iil质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500万。