植物细胞融合(实验).ppt

第六章 植物细胞融合（实验）,一、细胞融合的目的和意义 细胞融合能实现远缘杂交。其意义在于打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，有可能形成有性杂交方法无法获得的新型杂种植物，广泛组合各种基因型，扩大了遗传物质的重组范围。,二、细胞融合（cell fusion)概念 在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代的一些优良性状。,细胞在融合过程中发生的主要变化：呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用下，细胞膜的性质发生变化。首先出现细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在培养过程中多核细胞又进行核的融合而成为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。,三、细胞融合技术原理和方法 由于体外培养的细胞很少会发生自发融合（融合频率大约在10-410-6之间），因此要采用生物、化学或物理的方法人为地促使细胞融合。,促细胞融合的方法有：（一）病毒促进细胞融合 其中仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融合的融合剂。（二）化学融合剂促进细胞融合 主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂质、Ca2+配合物等。（三）电处理融合法,聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合 在众多的化学试剂中，PEG应用最为广泛，因PEG液比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合的能力更强。PEG是一种多聚化合物。,PEG诱导原生质体融合的机理：带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。,在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合，形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大，两个原生质体最终融合。,使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。,电融合（electrofusion technique)法：电处理融合法是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，使融合率大为提高。,Electroporator 2510 from Brinkmann,Model ECM830 from BTX,电融合过程的分子机制：是以电降解及双向电泳的联合作用为基础。通过电泳，两细胞膜紧密接触，且膜表面的蛋白质分子分离，产生了无蛋白的类脂区。,电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱，出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范德华力作用下，形成脂分子桥。由于连接处的细胞膜表面曲率大，处于高张力状态，在热力学上是不稳定的，所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。,A Alignment:Cells are brought into close contact by means of dielectrophoresis.,B Fusion pulse:A squarewave pulse of a mere 15 microseconds is applied in order to permeate the membrane.The membranes then fuse.,C Heterokaryon phase:The cell membranes are fused completely and the cytoplasm has mixed together.Only the nuclei remain separate.,D Entire fusion product:The nuclei are now fused as well.As a rule,the number of chromosomes is reduced.,Fusion phases of oat protoplasts(Avena sativa),实际操作：先把待融合的细胞或原生质体混合，取样置于100V/cm的高频交流电场中，在非均匀交流电场中形成项链状排列；,完整烟草原生质体（40）原生质体成串（40）,再用15V/cm直流电脉冲/微秒冲击细胞或原生质体的粘接点，细胞膜降解造成若干微孔，于是在膜之间形成通道，使细胞质得以交换；最后导致新的球状细胞的形成。,电融合法优点（与PEG法比较）：1、融合率高；2、重复性强；3、诱导仅发生在质膜接触部位，对细胞 或原生质体伤害小；4、融合是在同步状态下进行，活细胞数目多；5、装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像融合过程；6、免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控制性强。,Electrofusion,四、实验材料、试剂和仪器1.材料 无菌烟草叶片、洋葱根尖,2.试剂1）酶混合液 配制分两部进行：（1）将CaCl2.2H2O 7 mmol/L NaH2PO4.2H2O 0.7mmol/L MES 3 mmol/L 甘露醇 0.5 mmol/L 用重蒸馏水溶解，调pH5.6，定容为酶储备液，灭菌备用。,（2）使用时再加入：纤维素酶 R-10 0.8%果胶酶 R-10 1%因酶制剂经过高压灭菌处理后会失活，故先将酶储液灭菌，待用时再将酶制剂按比例加入到第一步已灭菌的酶液内。,2）配制CaCl2.2H2O 0.16mol/L（pH5.8-6.2 用于悬浮原生质体）3)PEG液：30%（w/v)PEG(MW=6000)CaCl2.2H2O 0.01mol/L kH2PO4 0.00074mol/L 山梨醇 0.1 mol/L 调pH 5.8-6.2；用时现配！,4）电融合液：甘露醇 0.6M CaCl2.2H2O 0.5mM pH 5.8,3.仪器 1）大型仪器：高压灭菌锅，超净工作台，离心机，倒置显微镜，电融合仪。,2）一般实验用品 大小培养皿，小烧杯，小滴管，刻度离心管，小漏斗，不锈钢网300目,五.实验步骤实验路线：,烟草叶肉及洋葱根尖原生质体酶解分离,提纯原生质体并调整原生质体密度,a.调整融合仪参数，电击使原生质体融合b.PEG法使原生质体融合,倒置显微镜观察并照相,实验步骤：1.取酶储液10ml，分别加入纤维素酶和果胶酶0.08g,0.1g，制备酶液。2.取材：烟草、洋葱根尖各0.7g 取洋葱根尖，并将其切成0.5cm长短大小放入小平皿中；取烟草叶片将其剪成0.5cm2 大小放入小平皿中。3.酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿中，放入250c培养箱酶解。洋葱约4h，烟草约3h。,4.观察酶解效果5.原生质体的分离和纯化 1）酶解后，用300目铜网过滤酶液，去除未酶解的杂质，将滤液收集在10ml离心管中。2）1000转/分离心3分钟，用吸管或移液枪弃上清（注意不要把收集的原生质体吸走）。3）用CaCl2.2H2O（约1ml）悬浮下面的原生质体（PEG法）；电融合法则用电融合液悬浮。4）显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多可重复1）3）操作。,纯化的原生质体图示,完整洋葱原生质体（40）,完整烟草原生质体（40）,6.原生质体的密度测定 用血细胞记数板记数。每一样品测定3次，根据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至5*105个/ml。7.原生质体的融合（一）PEG法 1）配制PEG液（5ml）30%（w/v)PEG(MW=6000)1.5 g CaCl2.2H2O 0.0074g kH2PO4 0.0005 g 山梨醇 0.0911g 调pH 5.86.2,2）将两种原生质体悬液等量混合3）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿78滴，每滴约0.1ml。然后静置10分钟，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层（应有35个平皿的重复）。4）用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置1015分钟。此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。,PEG法原生质体的融合图示,1、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体融合（40）,2、烟草叶肉和洋葱根尖细胞原生质体的异源融合,（二）电融合法 1）融合仪参数设置：成串电流频率0.5MHz,电压30V,成串时间1min,融合脉冲幅宽40S,融合电压150v,融合槽间距1mm 2）在融合小室中加入约100ul的原生质体悬浮液，将融合小室接好电极后至于倒置显微镜下，静置约3min，使悬浮的原生质体沉降到平板底部，同时打开成串脉冲输出开关及融合脉冲输出开关，使高压脉冲发生电路与融合小室接通。然后轻触脉冲触发开关，施加3次融合脉冲，每次间隔1s。融合脉冲后成串脉冲再保持1min。静置融合小室2030min，在显微镜下观察融合过程。,电融合法原生质体的融合结果,原生质体成串（40）,原生质体融合（图1）,电融合法原生质体的融合结果,原生质体融合（图2）,原生质体融合（图3）,Overall aims of research,To“capture”disease resistance from wild potato speciesTo use segregating populations to identify plant disease resistance genes and transfer resistance into potato cultivars,SOMATIC HYBRIDIZATION IN SOLANUM,Somatic hybridization using protoplast fusion,Isolate protoplasts(typically leaf mesophyll)from two parental linesFuse protoplasts either chemically(PEG)or using electrofusionCell membranes fuse forming one cell containing 2 nucleiOn cell division nuclear material condenses together and hybrids cells are formed that contain DNA from both parental lines.,Potato plants growing in a test tube,Freshly isolated potato protoplasts,Two protoplasts ready to fuse together,Fusion products begin to divide on nutrient medium,If the conditions are right,small shoots emerge from the green calli,Putative somatic hybrid plants,A fertile somatic hybrid,Phenotype of somatic hybrids clearly shows characteristics of both parents,S.brevidens somatic hybrid S.tuberosum,Phenotype of intraspecific diploids of S.tuberosum,US-W9310.3 Somatic hybrid US-W9545.99,Somatic hybrids have ALL of the chromosomes from each parent plant,Verticillium wilt resistance test field at Hancock,Wisconsin,Late blight resistance in backcross plant derived from somatic hybrids between S.bulbocastanum and potatoLine J101K6-A22 at Hancock Expt.Station,植物体细胞杂交,用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。打破了不同种生物间的生殖隔离限制，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围。,植物体细胞杂交过程示意图,Protoplast Fusion,