滇西八角中新颖的木脂素及其抗肝癌活性研究.docx

滇西八角中新颖的木脂素及其抗肝癌活性研究上海中医药大学田允I,陈思思1,巴铭钮I,奚嘉琦I,沈云亨2,田新慧I1 .上海中医药大学，交叉科学研究院，上海市2012032 .海军军医大学，药学院，上海市200433(PhyIOChemiStryIetIerS,2023,56,38-43,此项目获第16批大学生创新创业训练计划项目资助)指导教师：田新慧职称：副研究员中文摘要：本项目从滇西八角的枝叶中发现了两个结构新颖的木脂素，采用NMR、HRESlMS、CD光谱和酸水解法将它们的结构分别鉴定为Waceioxylaviculin(1)and9-O-D-xylopyranoside-9,-acetoxylvladinolF(2)0首次将木脂素3拆分为一对对映异构体(+)7S,8K-3a和(一)7'R,85-3b°化合物(+)7S,8%-3a时肝癌细胞JHH-7,SMMC-7721毒性显著(IC5o=4.77643M),但是对正常肝细胞QSG-7701,Lo2生长无影响(ICso=41.78-54.75M),在抗癌药物研发中显出独特优势。英文摘要：WediscoveredtwonewIignansnamely9r-acetoxylaviculin(1)and9-O-D-xylopyranoside-9,-acetoxylvladinolF(2)fromtwigsandleavesofIlliciummerrillianuni.Theirstructuresweredeteninedbyacombinationofspectroscopicandphysicochemicalanalyses.Compound3wasfirstseparatedintotwoenantiomersbychiralmethodsandtheabsoluteconfigurationsof(+)-3aand(一)-3bwereestablishedas7'S,8'RandTR,S'S,respectively.Compound(+)7'S,8'R-3ahadselectivecytotoxicityagainstthehepatomacelllinesJHH-7andSMMC-7721at4.77and6.43M,withlittleeffectonthegrowthofnonalhepaticcellsQSG7701andL02(IC50=54.75,41.78M),showingauniqueadvantageintheanti-livercancerdrugstudies.关键词：滇西八角：木脂素：抗肝癌活性国家级大学生创新创业训练计划支持项目O作者简介：田允(2001-),女，安徽省宿州人，药学2020级本科，中药学研究方向。田新慧(1984-),女,河南周口人，副研究员，中药学研窕方向。引言滇西八角(JwCiummenilliammi)为常绿乔木，是八角科八角属植物。它广泛分布在中国西南部和缅甸，生长在1500-2900米海拔的潮湿树林和开阔林中山。滇西八角的根皮、皮和果实在云南民间用来治疗风湿病。黄建梅等对滇西八角的果皮部位进行了系统研究，从中得到,系列Secaprezizaane-,anislactone-,eudesmane-5caryophyllene-,和Cadinene型倍半菇，其中笼状的泥co-PreZiZaane型倍半超最为常见田OL但是尚未有人对滇西八角的枝叶部位进行研究过，因此我们课题组对其枝叶部分进行了长期深入研究，从中发现了一个罕见的1311异丙基迁移，9,11裂环的松香烷型二砧，含有独特苯并27二氧二环3.2.1辛烷桥环片段的木脂素山“露药理机制研究表明，我们发现的木脂素(+AmerriHianoid能在l-10M浓度时能显著提高NGF诱导的PC12细胞中trkA受体的璘酸化水平，引起RasZERK信号通路中p-MEK,p-ERKl/2水平上升，并最终导致细胞分化率的升高皿。木脂素(+)-merrilliaquinone能剂量依赖性的诱导细胞凋亡、线粒体膜电位下降以及阻止G0/G1期，对肝癌细胞表现出显著的选择性细胞毒活性。在这篇文章中，我们报道了两个结构新颖的木脂素1和2,对映体(+)7SgR3a和(一)-77?,8S-3b的手性拆分和绝对构型确定，以及其他已知的木脂素4-17,它们均首次从滇西八角中报道。其中尤普麦特苯并吠喃型化合物9-13在八角属植物如地枫皮(Ldifengpi)-181,红花八角(7.dunnianum)ll9,2°1,野八角(LSimonSii)l2,122大八角(7.majus)23八角(/.verum)网和少药八角(Loligandmm)1251中广泛存在，可以作为八角属植物的化学标记物。而正丁烷型木脂素14和15仅在滇西八角中发现过，可以作为滇西八角区别于其它同属植物的化学标记物。此外在本文中，我们对所有化合物的细胞毒活性和构效关系进行了初步研究。结果与讨论化合物(1)为无色油状物。红外光谱显示出-OH的特征吸收3422.6cm-1,苯环的特征吸收2.8cm和-C=O的特征吸收1717.8cm。HRESIMS给出它的M-H-准分子离子峰m/z=547.2188(C28H35On的计算值为547.2543),由此得到它的分子式为C28H36On,不饱和度为11。IHNMR数据显示五个芳香氢=6.17,6.59,6.64,6.65,6.76ppm,两个甲基加=1.13,2.07PPm,两个甲氧基加=3.78,3.81PPm,端基糖质子信号加=3.15-4.51ppmo在=6.59(dd,J=8.0,2.0Hz),6.76(d,J=8.0Hz),6.64(br.d,=2.0Hz)处的ABX自选耦合系统表明存在一个1,3,4取代的苯环。在加=6.17(三),6.65(s)处的单峰表明存在一个1,2,4,5-取代的苯环。根据,3C,DEPT以及HSQC数据分析，显示该分子中有28个碳原子，包括一个谈基dc=171.7,七个季碳充=126.8,132.2,136.4,144.0,144.9,145.9,147.8,13个次甲基%=36.4,44.3,47.1,68.7,70.9,71.0,72.4,100.7,110.8,112.0,114.7,115.8,121.7,3个亚甲基加=32.4,66.6,66.6,4个甲基加=16.4,19.4,54.9,54.9(表1)。除去两个苯环、一个黑基和一个毗喃糖基,剩下的一个不饱和度提示该化合物中可能存在另外一个环。以上数据与从Polygonumaviculare中分离得到的化合物avicularin十分相似P”它们之间的区别在于化合物1中多出一组乙酰氧基的信号c=171.7,19.4;=2.07(3H,s),由HMBC谱中的CH3-2,m(2.07),CH2-9rb(4.26)与C-I"(<5c171.7)的远程相关可以推断出这个乙酰氧基与C-9r相连接。将化合物1进行酸水解后采用气相色谱分析糖的手性衍生物，确定了此化合物中所含的糖为-L4ft喃鼠李糖12儿基于耦合常数(J=ISHz)数值，我们判断鼠李糖的端基质子为-取向。在NOESY谱图中H-7(=3.82)与H-8z(=2.19)的相关，以及H-2(=6.64),H-6(=6.59)与H-8(=1.90)的相关确定了化合物1的相对构型。因此化合物1的结构被确定为9,-acetoxylaviculin(图1),该化合物为新化合物。1表1.化合物1和2在CD3OD溶液中的'H,13CNMR数据12NO友(inppm)<5h(JinHz)c(inppm)Sh(JinHz)1136.4,C133.2,C2112.0,CH6.64(br.d,2.0)109.2,CH6.96(br.d,2.0)3147.8,C147.7,C4144.9,C146.1,C5114.7,CH6.76(d,8.0)114.7,CH6.75(d,8.0)6121.7,CH6.59(dd,8.0,2.0)118.3,CH6.83(dd.8.0,2.0)747.1,CH3.82m87.9,CH5.49(d,6.5)844.3,CH1.90m51.5,CH3.62m966.6,CH23.15(dd,10.0,4.0)69.0,CH23.73m,3.92m3.74(dd,10.0,2.0)r126.8,C134.8,C2f132.2,C116.6,CH6.73s3,115.8,CH6.17s128.3,C4，144.0,C146.3,C5，145.9,C143.9,C6，110.8,CH6.65s112.8,CH6.71sT32.4,CH22.83m31.5,CH22.62(dd.7.5,1.5)8，36.4,CH2.19m30.3,CH21.92m9,66.6,CH24.14(dd.11.0,7.0)63.6,CH24.06(t,6.5)4.26(dd,11.0,4.0)“100.7,CH4.51(br.d,1.5)107.9,CH4.93(br.d,1.5)2”71.0,CH3.84m82.1,CH4.00m3”70.9,CH3.62(dd,9.5,3.0)84.3,CH4.00(dd,4.0,1.5)4”72.4,CH3.32(d,10.0)773,CH3.84m5”68.7,CH3.44m61.6,CH23.63m,3.74m616.4,CH31.13(d,6.0)171.7,C171.7,C2，”19.4,CH32.07s19.4,CH32.02sOCH3-354.9,CH33.78S55.0,CH33.81sOCH3-5'54.9,CH33.81s55.4,CH33.84s化合物(2)为无色油状物。红外光谱在3384.8cm-1显示了羟基的特征吸收，1734.4cm显示了酯谈基的特征吸收，1463.9,1505.4,1583.1,1605.8CmT芳香氨的特征吸收。低分辩质谱ESIMS给出M+Na离子峰w=557.3,M+C1离子峰/泌=569.3。高分辨HRESIMS给出M+Na+准分子离子峰m/z=557.2012（C27H34OnNa的计算值为557.1999）,由此得到它的分子式为C27H34On,不饱和度为11。化合物2的IHNMR核磁数据显示（表1）,该化合物中含有五个芳香氢=6.71,6.73,6.75,6.83,6.96,两个连氧次甲基=4.93,5.49,糖基质子的特征信号加=3.61-4.05,两个甲氧基加=3.81,3.84,一个甲基加=2.02。化合物2的部分1HNMR图谱与化合物1非常相似，表明该化合物中也具有1,3,4-和1,2,4,5-取代的苯环片段。综合分析,3C,DEPT和HSQC图谱显示分子中共含有27个碳原子，包括一个段基c=171.7,七个季碳c=128.3,133.2,134.8,143.9,146.1,146.3,147.7,Il个次甲基次=51.5,77.3,82.1,84.3,87.9,107.9,109.2,112.8,114.7,116.6,118.3,五个亚甲基c=30.3,31.5,61.6,63.6,69.0,和三个甲基c=19.4,55.0,55.4o化合物2WVladinolF的1H和13CNMR十分相似口叫但是化合物2中多出了乙酰基和嗽喃木糖的信号峰。根据HMBC谱图中CH32'（加=2.07）,CH2-9,（=4.06）与Cr（加=171.7）的远程相关,推断乙酰基与C-9,相连。由HMBC谱中Hj”（加4.93）与C-9（69.0）的远程相关，以及H-9b（加3.92）与C-I（诙107.9）的远程相关确定毗喃木糖和糖昔连接位置在C-9位。Itt喃木糖端基质子H-r（=4.93,br.d,J=1.5Hz）的耦合常数确定了该糖基与甘元通过位相连接。此外，D-毗喃木糖部分是通过对糖酸水解后的手性衍生物进行气相色谱分析来确定的。化合物2的相对构型是通过NOESY图谱中H-7（5.49）与H-5a（3.63）,H-9b（3.92）的相关，以及H-8（3.62）与H-2（6.96）,H-6（加6.83）的相关来确定，如（图2）所示。因此，化合物2被命名为9-O-D-xylopyranoside-9,-acetoxylvladinolF,该化合物为新化合物。化合物（3）为黄色针状结晶，熔点114.0-115.5oCo它的ESIMS给出M+Na+离子峰WIZZ=437.3,由此得到它的分子式为C24H30O6O化合物3的IH和储CNMR数据与文献报道化合物magnoshinin的数据致”初，因此将化合物3的结构确定为magnoshinin（图3）。然而化合物3的旋光度为零，提示它可能为外消旋体，为了充分研究每个对映异构体的绝对构型和生物活性，我们采用手性分离的手段对该化合物进行了拆分。采用HPLC和色谱柱ChiralpakIAcolumn（规格:0.46CmI.D.X15cm,流动相:hexane/IPAZDEA=70/30/0.1,流速：l.0mLmin,波长:254nm,温度：35。C）对化合物3进行手性分离，得到对映异构体（+）-3a（/R=3.289min）和（一）-3b3=4.162min）,它们具有相反的旋光方向和Cotton效应(图4)。化合物(+)-3a在204-226nm处具有负的Cotton效应，在227-257nm和258-282nm处具有正的Cotton效应，这与文献报道化合物(一)7S,8'R-mei11iaquinone的CD图谱极为相似口叫因此将(+)-3a的绝对构型确定为7S8R。同理，我们将(一)-3b的绝对构型确定为7R8S,它与化合物(+)-7,7?,8,S-merrilliaquinone的绝对构型一致。化合物3与merri11iaquinone的平面结构几乎相同，除了化合物3中C-2和C-5位甲氧基氧化成了merrilliaquinone中的酮基。此外，化合物(一)7R,8S3b的绝对构型通过合成的方法被进一步被确证(Salametal.,2022)。由以上结果可知，具有相似结构和相同旋光方向的化合物不一定具有相同的绝对构型，我们需要通过合成手段、计算ECD和实测CD图谱进行对比、X-射线单晶衍射中的空间群和Flank常数值来综合判断化合物的绝对构型B1图3化合物(+)7S8R3a和(一)7H8S3b的化学结构图(-)-7'R,8'S-3b图4.化合物(+)7S,8'K-3a和(一)7R,8S3b的CD谱图通过核磁、质谱、以及理化性质比对，我们将从滇西八角中分离鉴定的其他已知化合物分别鉴定为尤普麦特苯并吠喃型木脂素9-O-D-xylopyranosidevladinolF(4)l2,9-。/-D-XyloPyranoSidevladinolF(5)囤,isodiHydrocarinatidin(6)l32j,(7S,8/?)-dihydrodehydrodiconiferol网,4,9-dihydroxy-3,5r-dimethoxy-4z,7-epoxy-8,5,-neolignane-9,-ylacetate(8)叫四氢吠喃型木脂素O-ethylcubebin(9)l35,>(一)-chicanine(Io)IW,-cubebin(11)因1,卅CUbebin(12严,magnosalicin(13)l3,;正丁烷型木脂素magnosalin(14)网和adamanicin(15)叫二苇基丁内酯类木脂素hinokinin(16)1411；联苯型木脂素dehydrodieugenol(17),42,实验采用MTT法对所有化合物的细胞毒活性进行了检测,测试细胞类型包括肺腺癌细胞系A549,结肠癌细胞系HCT-116,乳腺癌细胞系MDA-MB-231,肝癌细胞系SMMC-772I和JHH-7。活性测试结果表明(表2),化合物(+)7S,8'R3a,13,15和17对结肠癌细胞和肝癌细胞HCT-116,JHH-7,SMMC-7721具有显著的细胞毒活性,其IC50值范围在3.34-18.20M,然而它们对肺癌细胞A549和乳腺癌细胞MDA-MB-231的毒性较弱©o=16.33-100M.此外化合物（+）-7S8R3a对肝癌细胞具有很强的细胞毒活性，但是其对正常肝细胞QSG-7701和L02生长几乎无影响，在未来抗肝癌药物研发中表现出独特优势。表2.化合物（+）7S,8'R-3a,（一）-7R8S3b.13.15,17的细胞毒活性测试结果化合物癌细胞类型A549HCT-116MDA-MB-231JHH-7SMMC-7721(+)-3a79.73±2.4315.92±0.2235.96±2.174.77±0.166.43±0.51(一)-3b>10049.51±1.8559.23±1.8926.64±1.5124.17±0.191344.00±1.7118.20±0.51>1008.23±0.161519.49±0.9510.55±0.7819.68±0.804.78±0.051722.16±1.208.18±0.561633±0.453.34±0.22Dox.0.15±().030.17±0.010.71±0.020.36±().020.32±0.01结论本研究从滇西八角中发现了两个结构新颖的木脂素(1，2)和15个已知木脂素(3-17)。这些化合物不仅增加了天然木脂素的结构类型，而且对八角属植物具有重要的化学分类意义。我们采用HPLC的手性分离方法分离得到一对对映异构体，通过综合分析CD光谱，与相似结构和合成产物进行对比等方法将他们的绝对构型分别确定为(+)7SHR3a和(一)7R,8S3b,本研究对相似结构化合物的绝对构型确定具有重要参考意义。生物活性检测结果表明,化合物(+)-7S8R3a,13,15和17对结肠癌细胞和肝癌细胞更为敏感(IC50=3.34-18.20M),尤其是芳基奈型木脂素(+)7S,8%3a和(+)7R8SmerriHi叫UilKme对肝癌细胞表现出显著选择性细胞毒活性。此外，化合物(+)-7S8R3a对肝癌细胞具有很强的细胞毒活性，但是它的对映异构体(一)-7X8S3b的毒性却较小，我们需要通过深入的作用机制研究来明确这对它们与肝癌细胞之间的不同作用模式。参考文献：1. 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