胶乳免疫比浊技术实验室测定标准.docx

ICS11.040.01CCSN54团 体标 准T/CRHA XXX-XXXX胶乳免疫比浊技术实验室测定标准1.aboratorymeasurementstandardoflateximmunoturbidimetricassay（征求意见稿）202X-XX-XX 实施202X-XX-XX发布中国研究型医院学会发布目次1范围22规范性引用文件23术语和定义23.1 胶乳免疫比浊技术23.2 空白限23.3 检出限24原料及原料性能评价方法34.1 胶乳颗粒34.2 交联蛋白35试剂性能要求45.1外观45.2装量45.3 空白吸光度45.4 分析灵敏度（空白限、检出限、定量限）45.5 线性范围45.6 可报告范围55.7 重复性55. 8批间差55.9正确度55.10稳定性55.11 抗干扰能力55.12 钩状效应66检测66.1检验项目及试验方法66.2试剂放行检测87质量保证98标识、标签和使用说明书108.1 试剂（盒）外包装标识、标签108.2 试剂（盒）内包装标识、标签108.3 试剂（盒）使用说明书109包装、运输和贮存119.1 包装119.2 运输119.3 3贮存11参考文献12本标准根据GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会提出。本文件由中国研究型医院学会归口。本标准起草单位：中国人民解放军总医院、中国医学科学院北京协和医院、北京大学第三医院、中山大学孙逸仙纪念医院、武汉大学中南医院、中国医科大学附属第一医院、北京大学第一医院、佛山市南海区人民医院、北京大学深圳医院、福建医科大学附属第一医院、北京怀柔医院、中南大学湘雅医院、潍坊医学院附属医院、北京九强生物技术股份有限公司本标准主要起草人：田亚平、张春燕、邱玲、禹松林、崔丽艳、吴永华、段朝晖、范俊丽、李花、李一荣、屈晨雪、蔡甜、夏勇、杨滨、杨曦、易斌、张维清、张旭光、张玺玉引言伴随着仪器、原料及生产技术的进步，基于胶乳免疫比浊法的检测试剂盒已经被越来越多的国内外厂家重视，带动了产品的研发和生产热潮。为了把关试剂盒的临床性能、分析性能和经济性能等各方面可满足临床实验室的使用需求，同时使试剂盒的生产更标准化和规范化，特制定胶乳免疫比浊技术实验室测定团体标准，供厂家和医学实验室参考。胶乳免疫比浊技术实验室测定标准1范围本标准规定了应用胶乳免疫比浊技术进行测定的试剂盒的术语和定义、原料及原料性能评价方法、试剂性能要求、试验方法、试剂盒标识、标签和使用说明书、包装、运输和贮存等。本标准适用于基于胶乳免疫比浊技术进行研发、生产和定量检测的试剂盒(以下简称：试剂盒)，包括在半自动、全自动生化分析仪、免疫分析仪上使用的试剂盒。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBfT29791.2体外诊断医疗器械制造商提供的信息(标示)第2部分：专业用体外诊断试剂WS/T420-2013临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证(Verificationofanalyticalperformanceofquantitativekitsbyclinicallaboratory)WS/T492-2016临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证(VerifiCatiOnofperformanceforprecisionandtruenessofquantitativemeasurementsinclinicallaboratories)CNAS-GL037:2019临床化学定量检验程序性能验证指南(GUidanCeontheverificationofquantitativemeasurementproceduresusedintheclinicalchemistry)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1胶乳免疫比浊技术IateXimmunoturbidimetricassay胶乳免疫比浊技术是免疫比浊法的一种。该方法将抗体包被在粒径适中的胶乳微球表面形成复合物，与待测物质结合后发生凝集现象，在可见光的范围内，光线可以通过胶乳颗粒被仪器检测到，且检测到的光线强度越强，待测物质的含量越高。胶乳免疫比浊技术取消了反复孵育和洗涤的过程，操作简便，检测时间短，可在短时间内进行批量检测，适用于各种主流生化平台，无需特殊设备即可进行，各层级医院均可开展，成本较低。4. 2空白限Limitofblank;LoB一定概率下，由给定测量程序测量空白样本可能得到的最高测量结果。5. 3检出限Limitofdetection;LoD一定概率下，由给定测量程序测量样本中待测物质的最小浓度或最小量。6. 4定量限Limitofquantitation;LoQ是指给定测量程序定量检测样本中待测物质的最低量，测定结果应具有一定准确度。7. 5分析证书CertificateofAnalysis;COA质量检测报告COA是产品出售前的质量检查，是鉴定产品质量达标的书面证明。COA文件是经过对产品、设备的质量检验得出，是保障产品质量体系的标准。4原料及原料性能评价方法7.1 胶乳颗粒7.1.1 直径采用动态光散射(DynamiCLightScattering,DLS)法，使用标准激光粒度仪，遵循仪器操作规程对胶乳颗粒进行测量，判定其直径是否在原料厂家COA声称的范围内。8. 1.2表面电荷密度采用电导滴定方法，使用标准电位滴定仪器，遵循仪器操作规程对胶乳颗粒进行测量，判定其表面电荷密度是否在原料厂家COA声称的范围内。9. 1.3分散性采用目测外观的方法，使用移液器吸取一滴胶乳颗粒到凝集板上，旋转摇晃凝集板，观察是否有凝集颗粒，如果存在凝集颗粒，可以判定原料分散性不合格。10. 1.4固体含量采用干燥失重的方法，滴加ImL胶乳颗粒到玻璃培养皿上，使用分析天平测量干燥前后的胶乳颗粒重量，使用公式“干燥后重量/干燥前重量*100%”计算固体含量，判定是否在原料厂家COA声称的范围内。11. 1.5微生物含量量取定量胶乳颗粒,平铺于琼脂培养基上进行微生物培养,一定时间后统计培养皿中产生的菌落数,判定微生物含量是否在原料厂家COA声称的范围内。4.1.6 酸碱度量取定量胶乳颗粒，使用校正后的PH计测量，判定酸碱度是否在原料厂家COA声称的范围内。4.1.7 空白吸光度根据不同检测项目的要求，量取定量胶乳颗粒使用去离子水稀释到一定浓度，使用分光光度计，设定570-80Onm范围内的波长范围检测稀释后的胶乳颗粒溶液吸光度，判定是否在原料厂家COA声称的范围内。4.2交联蛋白4. 2.1外观采用目测外观的方法，液体交联蛋白应为澄清透明的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀；干粉交联蛋白应为白色粉末，不含有其他颜色的杂质。5. 2.2蛋白含量采用二辛可酸(bicinchoninicacid,BCA)方法检测蛋白含量，判定是否在原料厂家COA声称的范围内。6. 2.3蛋白纯度采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）方法检测蛋白纯度，判定是否在原料厂家CoA声称的范围内。7. 2.4亲和力采用竞争醐联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）或表面等离子互作方法测量蛋白的亲和力，判定是否在原料厂家CoA声称的范围内。8. 2.5特异性采用蛋白质印迹法（WeStern-Blot,WB）测量蛋白的特异性，判定是否在原料厂家COA声称的范围内。9. 2.6功能性实验（小试）根据每个检测项目的配制工艺，将蛋白交联到胶乳颗粒上，配制少量胶乳试剂，检测加速稳定性、灵敏度、特异性等性能，判定是否符合产品性能要求。5试剂性能要求9.1 外观应根据产品的包装特点规定适当的外观要求，一般应有试剂盒各组分组成、性状，内、外包装、标签等的要求。a）试剂盒组分应齐全，内外包装应完整，标签清晰；b）液体试剂无渗漏，无肉眼可见颗粒、无沉淀。9.2 装量液体试剂的装量应不少于标示值。9.3 空白吸光度应规定试剂盒空白吸光度（八）的要求。测试血清/血浆/尿液/脑脊液样本试剂：试剂空白A应符合生厂商给定的范围。9.4 分析灵敏度（空白限、检出限、定量限）测试血清/血浆/尿液/脑脊液样本试剂：生厂商应给定试剂空白限/检出限/定量限的范围。9.5 线性范围测试血清/血浆/尿液/脑脊液样本试剂：生厂商应分别规定不同样本类型试剂线性范围。a）线性区间内，线性相关系数|川应不小于0.990；b）应规定线性区间内的线性偏差，可以根据实际情况，在线性区间的不同分段以相对偏差或绝对偏差表达。9.6 可报告范围测试血清/血浆/尿液/脑脊液样本试剂：生厂商应分别规定不同样本类型试剂可报告范围。a）可报告低限（定量下限）：对于低值样本，重复测试的变异系数（CV）W方法性能标示的总误差或不确定度。b）可报告高限（定量上限X样本最大稀释倍数）：对于高值样本，还原浓度与理论浓度的偏差（）W方法预期偏倚值。9.7 重复性应至少规定两个浓度控制物质重复测试的变异系数（CV）。测试血清/血浆/尿液/脑脊液样本试剂：用同一批次生产的试剂重复测定同一控制物质，其CV应W生厂商宣称。控制物质的浓度选择可参考医学决定水平，代表正常值和异常值水平。9.8 批间差应规定不同批号的试剂（盒）测试相同控制物质的差异，所得结果以批间相对极差（R）表示，其R应W生厂商宣称。9.9 正确度测试血清/血浆/尿液/脑脊液样本试剂，建议按如下优先顺序，采用下列方法之一测试试剂（盒）的准确度：a）相对偏差：生产商应规定相对偏差范围，其相对偏差应W生厂商宣称。b）比对试验：在线性区间范围内，待测系统与比对系统相关系数I应不小于0.975（或产应不小于0.95）：生产商应规定每个医学决定水平或参考区间限值的绝对偏差和相对偏差范围，其绝对偏差和相对偏差应W生厂商宣称。c）回收试验：生产商应规定回收率范围，其回收率应在生产商宣称范围内。9.10 稳定性在保证效期内产品性能符合要求的情况下，可根据产品特性选用以下方法的任意组合进行验证。a）效期稳定性：生产商应规定产品的有效期。在生产商规定的储存条件下，取近效期或过效期的样品检测5.1,5.35.9,结果应符合相应要求。b）热稳定性试验：在制造商规定的热稳定性试验条件下，检测5.1,5.3-5.9,结果应符合相应要求。注1：热稳定性不能用于推导产品有效期，除非是采用基于大量的稳定性研究数据建立的推导公式。注2：一般地，效期为1年时选择不超过1个月的产品，效期为半年时选择不超过半个月的产品，以此类推。如超过规定时间，但产品符合要求时也可以接受。注3：根据产品特性可选择a）,b）方法的任意组合，但所选用方法宜能验证产品的稳定性，以保证在效期内产品性能符合标准要求。9.11 抗干扰能力测试血清/血浆样本试剂，生产商应说明常见的可能产生干扰作用的物质，至少应考虑样本中的异常物质如：血红蛋白（溶血）、胆红素（黄疸）、甘油三酯（脂血）等。实验样本和对照样本的绝对偏差应W生厂商宣称，即满足干扰标准时的最高干扰物浓度，应符合检测方法规定的要求。10. 12钩状效应在抗体量恒定的溶液中加入抗原，免疫复合物的生成量随抗原量的增加而增加，当达到峰值之后，则随着抗原量的增加而减少，此现象被称为钩状效应。通常将抗体过量现象称为前带现象，抗原过量则称为后带现象，在胶乳免疫比浊检测试剂盒临床应用中偶有发生。必要时（包括但不限于病例浓度范围分布极宽的检测项目），生厂商应制定相应识别与应对策略。6检测10.1 验项目及试验方法10.1.1 观在自然光下以正常视力或矫正视力目视检查，应符合5.1的要求。11. 1.2装量用通用量具测量，应符合5.2的要求。6.1.3 空白吸光度用试剂（盒）测试空白样本，在主波长下，记录试剂（盒）参数规定读数点吸光度值（温度37.0°C±0.1C;比色皿光径1.0Cm）,应符合5.3的要求。注：空白样本应是纯化水、生理盐水、零浓度校准物质等。6.1.4 分析灵敏度（空白限、检出限、定量限）a）空白限：用试剂（盒）测试空白样本，重复测试20次，计算20次的测试结果的平均值（G）和标准差（SQ）,北+2SO应不大于空白限值，即符合5.4的要求。注：空白样本应是纯化水、生理盐水、零浓度校准物质等。b）检出限：生厂商应提供检测试剂盒的空白限、检出限等信息，根据此信息，对5份近似检出限的低值样本进行检测，每份样本至少检测5次，对检测结果按照测值高低进行排序，符合低于生产商提供的空白限数值的检测结果数量应不多于3个，即可认为生产商提供的检出限的设置基本合理，符合5.4的要求。c）定量限：生厂商应提供检测试剂盒的定量限等信息，根据此信息，对5份近似定量限的低值样本进行检测,每份样本至少检测5次,每个样本测定结果与参考值的偏差与实验室允许的总误差相比较,计算小于允许总误差所占比例是否符合5.4要求。如符合要求，则验证通过。一般而言，如果检测结果超出误差目标的个数W3个时，则验证通过。6.1.5 线性范围用接近线性区间下限的低浓度样本稀释接近线性区间上限的高浓度样本,混合成5个以上的稀释浓度U）o用试剂盒分别对这些样本进行测试，每个稀释浓度测试3次，求出每个稀释浓度检测结果的均值（V）O以稀释浓度U）为自变量，以检测结果均值（y）为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数（不，应符合5.5的要求。建议加入1.1.1 1.6可报告范围以方法性能标示的总误差或不确定度为可接受界值,从低值样本结果数据中选取总误差或不确定度等于或小于预期值的最低浓度水平作为可报告范围低限。选取还原浓度与理论浓度的偏差（）等于或小于方法预期偏倚值时的最大稀释倍数为方法推荐的最大稀释倍数,测量区间的高限与最大稀释倍数的乘积为该方法可报告范围的高限。可报告范围高限的确定应考虑临床需求，并符合5.6的要求。其验证方法可参考CNAS-GL037：2019临床化学定量检验程序性能验证指南。6.1.7 重复性在重复性条件下，用试剂盒测试控制物质，各重复测试10次，计算测量值的平均值（M）和标准差（SO）。按式（1）计算变异系数（CV）,结果应符合5.7的要求。SD（1）CV=-X100%WX式中：CV变异系数；SD标准差；X测量值的平均值。6.1.8 批间差用3个不同批号的试剂（盒）分别测试相同控制物质，每个批号测试3次，分别计算每批3次检测的均值Gj（/=1,2,3）,按式（2）、式（3）计算相对极差（R）,应符合5.8的要求。Xl÷Jt2÷×3XT=3一1.=J后j100%式中：r总平均数；R柑寸相对极差；xutr中的最大值；fmi舄中的最小值。6.1.9正确度相对偏差：用试剂（盒）对可用于评价常规方法的标准物质、有证参考物质（CRM）或可溯源的企业参考品进行测试，或由参考方法定制的高、中、低3个浓度的人源样品（可适当添加被测物，以获得高浓度的样品）3次，按式（4）计算相对偏差（B）；3次测定均值与标识值的相对偏差应符合5.9的要求。如果大于等于2次的结果不符合，即判为不合格。如果有1次结果不符合，则应重新连续测试20次，并分别按式（4）计算相对偏差，如果大于等于19次测试的结果符合，则准确度符合要求。M-T（4）B=-×100%T式中：M测试结果；T有证参考物质表示值，或各浓度人源样品定值。回收试验：在人源样品中加入一定体积标准溶液标准溶液体积与人源样品体积比应不会产生基质的变化，加入标准溶液后样品总浓度应在试剂（盒）检测线性范围内或纯品，每个浓度重复检测3次,计算均值，按式（5）计算回收率，回收率应符合5.9的要求。C×（VoV）-Cq×Vq（5）l收=-IZ3-×oo%式中：R臼收回收率，%；V加入标准溶液的体积；Vn加入人源样品的体积；c人源样品加入标准溶液后的检测浓度均值；Qj人源样品的检测浓度均值；c标准溶液的浓度。比对试验：参照EP9-A2的方法，用不少于40个在检测浓度范围内不同浓度的人源样品，以生产企业指定的分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂（盒）操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数（冷及每个浓度点的相对偏差，应符合5.9的要求。6.1.10稳定性效期稳定性试验：取到效期后的产品，按6.1.1、6.1.36.1.9的方法进行检测，应符合5.10a）的要求。热稳定性试验：取有效期内的产品，根据生产商规定的热稳定性条件，按6.1.1、6.L36.1.9的方法进行检测，应符合5.10b）的要求。6 .1.11抗干扰能力宜选取2个不同浓度水平的样本为基础样本，可参考医学决定水平或参考区间限值。干扰物原液中干扰物的浓度应高于实验浓度20倍以上，以减少对基础样本基质的稀释作用。实验样本与对照样本的制备方法可参考WS/T416-2013表2,重复检测（n23）实验样本和对照样本，分别计算两组结果均值，和均值间的差值，应符合5.11的要求。其具体验证方法可参考CNAS-GL037临床化学定量检验程序性能验证指南。7 .1.12钩状效应针对钩状效应常用的解决方案，目前一般有3种，可选用其中的1种或多种策略识别及应对可能出现的钩状效应：a）样本预稀释：针对部分项目，将样本进行10倍及以上预稀释处理，对高浓度水平样本可有效减少钩状效应，但对于低浓度水平样本，稀释操作引入了一定量的分析前变异，应额外注意低浓度样本检测结果的准确性：b）反应曲线特征识别和报警：各实验室可根据不同项目的抗原一抗体反应动力学特征，在反应曲线的特定时间点监测生成的免疫复合物的A值，计算反应不同时段A值变化的比值，与预设参数进行比较，自动识别钩状效应：c）抗原或抗体的二次添加：即在反应过程中再次添加一定量的试剂（抗体）或样本（抗原），根据时间一反应进程曲线是否发生改变、拐点的上升或下降来判断是否存在抗原过量，如有过量,进行稀释操作。1.2 试剂放行检测在厂商对产品包装完成后，至产品发货前，需通知质量部，由检验员对待发货的每一个产品进行放行检验。1.3 .1放行检验原则检验员应分产品、分批号、分规格的逐步检查，检验时不得有任何其他物料，不得多批次多规格同时检验。6. 2.2检查及出库放行当5.1、5.2和5.6检验项目均合格后，应由相关质量部门出具成品放行报告，仓库管理员依据成品放行报告进行发货。7质量保证6.1 检验前质量保证6.1.1 样本采集应符合以下要求：a）应避免样本溶血，影响检测结果的准确性；b）样本应避免与空气接触，采集样本后应即刻混匀，即刻检验；O如因特殊原因，样本无法即刻检验，应贮存于28C冰箱，24h内完成检验，样本长时间放置会导致测定值出现较大偏差。6.1.2 样本质量确认检验操作者应对样本质量进行确认，溶血、微小凝块、干扰物质和气泡等因素会影响检验结果，严重不合格样本应拒绝接受并重新采样。6.2 室内质量控制7.2.1计划制定应按GB/T20468的规定执行，制定适宜的内部质量控制计划，包括但不限于：a）研发/生产/临床实验室应遵循企业/医院内质量管理制度，制定实验室适合的质量控制计划；b）每月或规定时间内保存和上报室内质量控制数据图表；c）每月或规定时间内进行室内质量控制数据的评价。7. 2.2具体执行室内质量控制按GB/T22576.1的规定执行，应符合以下要求：a）应定期检验质控品，检验频率应基于各项目检验程序的稳定性和错误测值对患者危害的风险而确定，宜采用自动化过程质量控制管理；b）当违反质控规则并提示检验结果可能有明显错误时，应拒绝接受检验结果并采取纠正措施，验证试剂性能合格后重新检验样本；c）应定期评审质控数据，监测试剂性能变化趋势以尽早发现可能影响检验结果的问题，一经发现应即刻采取预防措施并记录。7. 2.3质控品a）质控品选择：应按WS/T641的规定执行，尽量使用与检验系统响应方式接近患者样本的物质，宜选择覆盖临床医学决定水平或与其浓度接近的质控品；b）适用类型：质控品的类型宜包括但不限于液体质控品，宜考虑使用独立第三方质控物质。如适用，可按照生产商的说明运行配套质控程序，形成质控图及失控纠错报告并记录存档。7.3室间质量评价应参加适宜的实验室比对计划，包括但不限于能力验证计划及外部质量评价计划等。宜参加满足GB/T27043相关要求的实验室比对计划。未开展能力验证计划的实验室，宜使用生产商或第三方的标准物质或性能验证品。8标识、标签和使用说明书应符合GB/T29791.2的规定。8.1 试剂（盒）外包装标识、标签至少应包含如下内容：a）产品名称及包装规格；b）生产企业或售后服务单位的名称、地址、联系方式：c）医疗器械注册证书编号；d）产品标准编号；e）产品批号；f）失效期；g）贮存条件。8.2 试剂（盒）内包装标识、标签至少应包含如下内容：a）产品名称及包装规格；b）生产企业名称或标志：c）产品批号；d）失效期；e）贮存条件。8.3 试剂（盒）使用说明书至少应包含如下内容：a）产品名称；b）包装规格；c）预期用途；d）检验原理；e）主要组成成分：f）贮存条件及失效期；g）适用仪器；h）样本要求；i）检验方法；j）参考值（参考范围）；k）检验结果的解释；1）检测方法的局限性；m）产品性能指标；n）对分析干扰（溶血、脂血、黄疸、药物等）的说明；o）注意事项；p）参考文献；q）生产企业或售后服务单位的名称、地址、联系方式;r）境内医疗器械生产企业应注明生产企业许可证编号;s）医疗器械注册证书编号；t）产品标准编号；u）说明书批准及修改日期。9包装、运输和贮存9.1 包装包装应符合以下要求：a）试剂（盒）的包装应能保证免受自然和机械性损坏；b）如适用，包装内应附有使用说明书及产品检验合格证。9.2 运输试剂（盒）应按照生产商合同规定的条件进行运输。9.3 贮存试剂（盒）应按照生产商的要求进行贮存。参考文献1GBT3358.12009统计学术语第1部分:一般统计术语与用于概率的术语GB/T261242011临床化学体外诊断试剂（盒）3 WS/T1241999临床化学体外诊断试剂（盒）质量检验总则4 GB/T29791.2体外诊断医疗器械制造商提供的信息（标示）第2部分专业用体外诊断试剂5 CLSIEP05-A2Evaluationofprecisionperformanceofquantitativemeasurementmethods;approvedguideline-Secondedition.6 CLSIEP06-AEvaluationofthelinearityofquantitativemeasurementprocedures:astatisticalapproach;approvedguideline.7 CLSIEP07-A2Interferencetestinginclinicalchemistry;approvedguidelineSecondedition.8 CLSIEP09-A2Methodcomparisonandbiasestimationusingpatientsamples;approvedguideline一Secondedition.9 CLSIEP17-A2.Evaluationofdetectioncapabilityforclinicallaboratorymeasurementprocedures;approvedguidelineSecondedition.10 CouncilDirective98/79/ECoftheEuropeanparliamentandofthecouncilof27October1998oninvitrodiagnosticmedicaldevices,officialjournaloftheEuropeanunionL331,December7,1998.11YYT1255-2015免疫比浊法检测试剂（盒）（透射法）12 WS/T4202013临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证13 WS/T4922016临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证