绵羊胚胎移植技术规程.docx

ICS65.020.30CCSB43H12天津市地方标准DB12TXXXXX-2022绵羊胚胎移植技术规程Technicalregulationsforembryotransferofmeatsheep2022-XX-XX发布2022-XX-XX实施天津市市场监督管理委员会发布本文件按照GB/TL1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由天津市农业农村委提出并归口。本文件起草单位：天津市农业科学院。本文件主要起草人：张金龙、张效生、郭晓飞、葛慎锋、李义海、冯靖、姚大为、李玉鹏、董春晓、王彪、陈龙宾。绵羊胚胎移植技术规程1范围本文件规定了绵羊胚胎移植技术中实验室准备、供体羊冲胚、检胚及胚胎质量鉴定、受体羊胚胎移植等技术要求。本文件适用于绵羊胚胎移植。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T816肉羊饲养标准DB12/T137肉用绵羊饲养管理技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1胚胎移植embryotransfer将一头母畜（供体）的受精卵取出，移植到另一头母畜（受体）体内，使之继续发育至分娩产仔。3.?供体羊donorsheep提供胚胎的母羊。3. 3受体羊receptorsheep接受胚胎的母羊。4实验室准备3.1 试剂、药品参见附录A、附录B3.5 设、耗材参见附录C。3.6 胚胎室要求4. 3.1地面进行硬化、防滑处理，门窗密封、严紧、无尘。4. 3.2室内顶部安装紫外线灯。4. 3.3室内环境温度保持在2025C,避免阳光直射。5供体羊冲胚4.1 供体羊选择4.1.1 供体羊谱系清楚、遗传稳定，品种优良、生产性能好；4.1.2 体质健壮，年龄在1岁4岁；4.2 供体羊饲养管理保持稳定的饲养环境，避免应激，饲养符合DB12/T137、NY/T816规定。4.3 同期发情在母羊发情周期的任意一天放置孕酮栓，具体参见附录D。4.4 超数排卵母羊放置孕酮栓后第10天开始注射促卵泡素（FSH）,2次/天，连续4天，具体见附录D。4.5 发情鉴定取出阴道栓后每隔8小时用公羊试情1次，以母羊站立接受公羊爬跨为母羊发情标准。5. 6人工授精5. 6.1母羊判定发情后8小时进行人工输精，输精两次，间隔8小时12小时。5. 6.2输精量0.2ml只.次0.4ml只.次，每次输精有效精子数不少于3.0x10,。5.7胚胎收集5.7.1胚胎收集时间，参见附录D。5.7.2术前准备供体羊在手术前12小时空腹、禁水。5.7.3供体羊手术5.7.3.1乳房前，腹部备皮，范围20CnIX20cm。备皮后用5%碘酊棉球消毒，再用75%酒精棉球脱碘。5.7.3.2供体羊仰卧保定于手术床上，肌肉注射麻醉，麻醉后,使手术床与地面成45。5.7.3.3在乳房前2cm3cm,腹中线侧面做5cm的纵向切口，依次切开皮肤、肌肉和腹膜。5.7.3.4从切口处取出子宫角，记录卵巢黄体的数量。5.7.4冲胚5.7.4.1在子宫角大弯处用止血钳尖扎孔，将冲胚管插入，用注射器充气使冲卵管的气囊封闭一侧子宫角，冲卵管的另一端接90mm平皿。5.7.4.2冲卵针从子宫角末端向子宫角大弯方向刺入，使冲卵针、子宫角和冲卵管形成通路。5.7.4.3用注射器吸30ml冲胚液注入冲卵针冲洗子宫角，将液体经过冲卵管回收至90mm培养皿中。5.7.5创口缝合5.7.5.1冲胚完成后，将子宫送回腹腔。5. 7.5.2缝合创口，肌肉腹膜连续缝合、皮肤结节缝合，皮肤前创口撒消炎粉。6. 7.5.3缝合完成后进行创而整理，碘酊消毒，注射抗生素和解麻药物，解除保定。6检胚及胚胎质量鉴定6.1 检胚6.1.1 在35mm的培养皿中注入胚胎保存液，放在恒温台上预热。6.1.2 将收集到的冲胚液移至实体显微镜下，检出胚胎，移入35mm的培养皿中。6.1.3 每个平皿在显微镜下重复检查3次，检出平皿中所有胚胎。6.2 胚胎质量鉴定7. 2.1胚胎发育阶段和质量鉴定，参见附录E。6.2.2鉴定后的胚胎做好记录，包括羊号、胚胎发育阶段、质量等信息，见附录F。6.3胚胎装管6.3.1在体视显微镜下，将鉴定后的胚胎装入胚胎移植枪中，准备移植。6.3.2胚胎装入移植枪按照三段液滴两段空气，胚胎液滴位于移植枪的中间段。7受体羊胚胎移植1.1 受体羊选择有正常的发情周期，无繁殖机能疾病，年龄在1胎以上的母羊。75受体羊饲养管理受体羊组群加强饲养管理，保持环境相对稳定，避免应激，饲养符合DB12/T137、NY/T816规定。1.3 同期发情受体羊同期发情方法，见附录D。1.4 受体羊移植7. 4.1受体羊在移植前12小时空腹，禁水。8. 4.2术部备皮同步骤5.7.2,9. 4.3受体羊黄体观察：a）手术法：参考供体羊手术5.7.2,取出子宫和卵巢，观察黄体数量和颜色，进行记录；b）腹腔内窥镜法：在受体羊乳房前2cm3cm腹中线两侧做各做一个创口，通过腹腔内窥镜观察黄体数量、大小和颜色，并取出有黄体测的子宫角，进行记录。7.4.4在子宫角细段扎孔，将装有胚胎的移植枪通过该孔导入子宫角，推出胚胎，将子宫角送回腹腔内。7.4.5缝合创口，创口撒消炎粉，碘酊消毒，注射抗生素和解麻药物，解除保定。7.4.6受体移植记录包括受体羊号、移植时间、移植胚胎数和胚胎登记等信息，见附录G。7.4.7移植胚胎后的受体羊，避免应激反应，饲养管理符合DB12/T137、NY/T816规定。附录A（资料性）同期发情、超数排卵耗材同期发情、超数排卵耗材见表A.1。表A.1同期发情、超数排卵耗材名称用途1孕酮栓供、受体羊同期发情2促卵泡素（FSH）供体羊超数排卵3孕马血清促性腺激素（PMSG）供、受体羊同期发情-1促黄体素释放激素（LH）供体羊同期排卵5冲胚液子宫角冲胚6胚胎保存液（Holding）胚胎体外保存附录B（资料性）常规耗材常规耗材见表B.1。表B.1常规耗材名称用途1手术器械1套供、受体羊手术2消炎粉手术创口消炎3缝合线手术创口缝合-1冲卵管子宫角冲胚5冲卵针子宫角冲胚6胚胎移植枪受体羊移植胚胎用790mm培养皿收集冲胚液用835mm培养皿胚胎保存和质量鉴定975%酒精手术部位消毒10碘酊手术部位消毒11抗生素供、受体羊手术后抗感染附录C（资料性）胚胎移植设备胚胎移植设备见表C.1。表C.1胚胎移植设备名称用途1移动紫外灯实验室消毒2水浴锅生理盐水和冲胚液加热、保温3手术床供、受体羊保定-1生物显微镜精子活力检查5腹腔内窥镜输精和移植胚胎用6体视显微镜检胚和胚胎质量鉴定恒温台胚胎恒温操作附录D(资料性)绵羊胚胎移植方案绵羊胚胎移植方案见表D.1。表D.1绵羊胚胎移植方案名称用途第0天埋植孕酮栓埋植孕酮栓第10天肌注FSH第"天肌注FSH第12天肌注FSH第13天肌注FSH,撤去孕酮栓撤去孕酮栓，肌注PMSG第14天肌注PMSG,人工输精第15天发情羊肌注促黄体素(LH),人工输精观察发情第21天胚胎收集移植胚胎附录E（资料性）胚胎鉴定E.1胚胎的发育阶段鉴定：a）桑根胚：5天6天，只能观察到球状细胞团，分不清分裂球，细胞团占据卵黄腔大部分；b）致密桑根胚：6天7天，细胞团变小，占卵黄腔的60朴70乐c）早期囊胚：7天8天，细胞团一部分出现光亮胚胞腔，细胞团占据70%-80即难以分清内细胞团和滋养层；d）囊胚：7天8天，内细胞团和滋养层界限清晰，胚腔明显，细胞充满卵黄腔；e）扩张囊胚：8天9天，囊胚腔明显扩大，体积增大到原来的L5倍，与透明带无间隙，透明带变薄；f）孵化胚：9天11天，胚胞腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出；g）凡在6推荐8天回收的16细胞以下的胚胎均列为非正常发育胚胎，不宜使用。E.2胚胎质量鉴定：a）A级：胚胎形态完整，轮廓清晰，分裂球均匀，紧凑，色调、透明带适中，无附着细胞和液泡；b）B级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到少量附着细胞和液泡，变性细胞占10%20%;c）C级：轮廓不清晰，色调发暗，结构松散，游离细胞和液泡多，变性细胞占20%50机附录F（资料性）供体羊冲胚记录供体羊冲胚记录见图F.L供体羊冲胚记录品种：年龄：供体号与配公羊:发情时间：冲胚时间J黄体数未受精卵可用胚总获卵数EMMEBEXB内细胞团合计L左R右采卵人员，检胚人员.记录人.图F.1供体羊冲胚记录附录G（资料性）受体羊移植记录受体羊移植记录见图G.1。受体羊移植记录移植时间：序号受体羊号左侧卵巢右侧卵巢胚胎移植位置备注卯泡数黄体数卵泡数黄体数供体系谱数量及等级123456789101112131415图G.1受体羊移植记录