自动化分析(免疫比浊).ppt

临床免疫学检验,免疫检验自动化分析仪,免疫比浊分析的临床应用,如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、；补体C3、C4；血浆蛋白AAT、TRF、A1M、CER、HPT、PAB、ALB；炎性反应蛋白 SAA、CRP；载脂蛋白 APO、ABI；尿蛋白系列小分子治疗药物,检范围测,血浆、体液中特种蛋白,概括：免疫比浊测定原理，以及影响免疫比浊的因素。,原理：免疫当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。影响因素：抗原抗体的比例，反应体系中保持抗体过量；抗体的质量，要选择特异性强、效价高、亲和 力强的多抗；抗原抗体反应的溶液，合适的PH（6.58.5）和离子强度；使用增浊剂可增强检测信号。,免疫比浊分析技术发展,自动化免疫比浊,两个阶段,测定抗原抗体形成后的阶段 散射(终点)比浊,测定抗原抗体结合的峰值 速率散射比浊,免疫比浊法分类,当一束光线通过溶液受到光散射和光吸收两个因素的影响而使光的强度减弱,透射比浊法:在光源的光路方向（00）测量透射光强度和被检测溶液微粒浓度关系的方法。,散射比浊法:在光源的光路方向（50-960）角的方向上测量透射光强度和被检测溶液中微粒浓度关系的方法。,一、散射免疫比浊分析原理散射比浊法：在液相中可溶性抗原、抗体特异性结合，形成一定大小的复合物粒子，当入射光沿水平轴照射在粒子颗粒上时，光线被颗粒吸收或折射，发生偏转.散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。,影响散射信号的因素(了解)如入射光的波长、偏振、微粒大小、浓度、质量、以及检测点的距离。,颗粒直径比入射光波长小的多，散射光的分布比较均匀。颗粒直径接近入射光的波长，其散射光的分布呈明显不均匀,Rayleigh散射,Mile散射,（一）散射颗粒与散射光,Rayleigh原理：即散射光的强度与复合物的量呈正比，与散射光的夹角呈正比，与波长呈反比。在散射比浊中，增加抗原-抗体复合物的体积，减小入射光的波长，扩大散射光夹角等因素，均可增加检测的敏感度。,（二）反应物含量与散射浊度,Heidelberger曲线 即当抗体量恒定时，形成的抗原抗体复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。同时，散射信号随抗原抗体反应时间增加而曲线上升。,当抗原量与响应值上升到一极限时，再增加抗原量，使散射响应值迅速下降,散射比浊测定时，一定要保证抗体过量。,二、定时散射比浊分析（一）基本原理,1.是将沉淀反应与散射比浊分析相结合，“在抗原抗体反 应几秒钟后开始测定峰值信号”。2.目的是排除抗原抗体反应的不稳定性，降低检测误差。3.采用抗体过量，以获得颗粒产生的最强的散射光信号。,时间检测分两个,在预反应时段，加小量样本与抗体反应，测定第一次散射光信号值,加全量样本，约反应 2分钟后，第二次测定散射光信号,信号峰值计算机处理转换为样品浓度,（二）抗原过量检测,抗体过量 在检测中抗体结合抗原的能力可达到相当于正常 血清的50倍以上，以保证高浓度样本中的抗原与 抗体的结合。对抗原过量进行阈值限定 先测定预反应时段抗原-抗体复合物的散射光信 号，若未超过阈值，可进行全量样本测定。若超 过阈值，提示样品浓度过高，需稀释后测定。,采用两项保证措施：,三、速率散射比浊分析,三、速率散射比浊分析（一）基本原理,是测定抗原抗体结合反应的动态过程。所谓速率，是在单位时间内抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时，即出现速率峰，该峰 值的高低，即代表所 测抗原的量。,四、免疫透射比浊分析（一）基本原理,当光源的光路（角度与正前方夹角为00时），通过一定体积的溶液，由于溶液中抗原抗体结合复合物粒子对入射光因反射、吸收或散射而衰减。透射光的强度和形成的复合物的量呈反比。,检测器,检测器,光源 透镜 滤光片,平光线,散,射,光,透射光,散射比浊、透射比浊光路图,实验要求（了解）,溶液中形成的复合物分子应足够大(35-100nm)溶液中形成的复合物分子要足够多 控制抗原抗体反应的温度和时间 加促凝剂，提高复合物形成速度，缩短检测时间 应选择亲和力好、效价高的抗体，保证抗体过量 将标准品稀释至少5个浓度测定，以吸光度值(A)为纵坐标，浓度为横坐标，在半对数纸上绘出标 准曲线，,