SNT5665-2023鲁氏耶尔森氏菌检测技术规范.docx

ICS11.220CCSB41SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T56652023鲁氏耶尔森氏菌检测技术规范QuarantineprotocoIforYersiniaruckeri2024-07-01实施2023-12-29发布中华人民共和国海关总署发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关动植物检验检疫技术中心、中华人民共和国黄埔海关技术中心、中华人民共和国福州海关、中华人民共和国天津海关、中华人民共和国武汉海关、华中农业大学。本文件主要起草人:王津津、陈兵、陈进会、吴江、刘茂、王乃福、史秀杰、于力、杨俊兴、郑晓聪、王武军、陈孝宇、任向阳、麦晨、秦智锋。鲁氏耶尔森氏菌检测技术规范1范围本文件描述了鱼类鲁氏耶尔森氏菌的分离培养、聚合酶链式反应和生化鉴定方法。本文件适应于鱼类鲁氏耶尔森氏菌的实验室检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BHIA：脑心浸出液琼脂(Brainheartinfusionagar)；DNA：脱氧核糖核酸(DeC)XyribOnUdeiCaCid);dNTPs:脱氧核糖核苗酸三磷酸(Dee)XynUCIec)tidetriphosphates)；EB：；臭化乙锭(EthidiUmbromide)；PBS：磷酸盐缓冲液(Phe)SPhatebufferedsaline)；PCR：聚合酶链式反应(PolymeraSeChainreaction)；TSA：胰蛋白月东大豆琼脂(TryPte)nesoyagar)o5概述鲁氏耶尔森氏菌(YerSiniarUCkeri)属于肠杆菌科(EnterObaCteriaCeae),耶尔森氏菌属(YerSinia),是一种能够引起水生动物，特别是冷水鱼类和温水鲤科鱼类发生肠炎红嘴病(EnteriCredmC)Uth,ERM)的条件性致病菌。由该菌引起的疾病的临床症状、流行病学等见附录A。6试剂和材料1.1 胰蛋白月东大豆琼脂(TSA),见附录B中B.1。1.2 脑心浸出液琼脂(BHlA),见B.2。1.3 氧化酶试剂，见B.3。1.4 革兰氏染色液，见B.4。1.5 磷酸盐缓冲液（PBS）,见B.5。1.6 商品化的生化鉴定试剂盒。1.7 水：用于PCR（包括核酸抽提）的水要用DEPC处理，以除去DNA酶和RNA酶。其余用水应符合GB/T6682一级水的规格。6. 8Taq酶：-20保存，避免冻融或温度剧烈变化。6.9dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/Lo6. 10PCR引物的设计是基于鲁氏耶尔森氏菌的16SrRNA基因的部分序列，浓度为20moL序列如下：yer3：5'-cgaggaggaagggttaagt-3,;YER45-AAGGCACCAAGGCATCTCT-3'；扩增片段大小587bpo7仪器和设备7. 1剪刀和银子。7.2 培养皿。7.3 恒温培养箱。7.4 普通冰箱和超低温冰箱。7.5 显微镜。7.6 禺心机和禺心管。7.7 微量移液器及吸头。7.8 PCR扩增仪。7.9 电泳仪或全自动毛细管电泳仪。7.10 紫外观察灯或凝胶成像仪。7.11 全自动微生物鉴定系统。7.12组织匀浆机或无菌研钵。7.13生物安全柜。7. 14恒温水浴锅。7. 15涡旋振荡器。8样品处理8.1采样8. 1.1按GB/T18088的规定采样。8.1.2无临床症状的鱼,无菌采集其肾、肝、脾等。8. 1.3对于体表有临床症状的鱼，可采取其病灶深处的组织。8.2处理8.2. 1用于分离培养的样品，直接将采集的组织用无菌接种环接种培养基。8.2.2用于PCR检测的样品，将采集的组织置于无菌离心管中，加入5倍体积灭菌PBS（见B.5）,使用组织匀浆机充分匀浆Imin2min（如无组织匀浆机，则将样品放入无菌研钵中充分研磨），然后将制备好的组织悬液在4800Og离心10min,取上清液转入另一无菌离心管中，备用。9核酸检测方法9. 1核酸抽提将处理好的组织样品或者疑似为鲁氏耶尔森氏菌的细菌分离物加到含有20L蛋白酶K（见B.6）和180L缓冲液（见B.7）的1.5mL离心管中,上下颠倒混匀,将匀浆液置于56水浴冰浴1h3h;向匀浆液中按1:1比例加入酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（见B.8）,上下颠倒混匀，120OOg离心5min;转移上层水相，加入等体积三氯甲烷/异戊醇混合液（见B.9）,上下颠倒混匀，12Ooog离心5min;转移上层水相，加入两倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min至过夜；14Ooog离心15min,沉淀DNA,倾去上清液；于沉淀中加入75%乙醇溶液500L,轻轻混匀后140OOg离心15min,倾去上清液，室温晾干；用30L灭菌双蒸水溶解DNA沉淀，冰上保存备用。若需长期保存，应放置在-20。C保存。也可使用等效的商品化试剂盒抽提核酸。9.2 PCR扩增在PCR管内，加入10×PCRBUffer（不含Mg2+）5ML、25mmol/L的MgSO45ML、5ULTaqDNA聚合酶1mL、20moL的引物对，YER3/YER4各1ML、10mmol/LdNTPs1ML、样品核酸5pL、补充灭菌水至50Lo94预变性2min;之后94°C变性40s,60°C退火40s,72°C延伸1min,共30个循环；最后72延伸5min,4保温。9.3 电泳用TAE电泳缓冲液（见B.10）配制1%2%的琼脂糖凝胶（含1gmLEB,见B.11）°将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6L样品和溪酚蓝指示剂溶液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子质量标准参照物作对照。5V/cm电泳约0.5h,当澳酚蓝到达底部时停止。在凝胶成像仪或紫外投射灯下观察有无DNA带并判定结果。也可使用全自动毛细管电泳仪进行电泳。9.4 测序和分析对扩增产物进行序列测定，测序结果与GenBank中的序列进行比对（按附录C）09.5 结果判定将标准菌株的核酸设立为阳性对照，空白对照、阴性对照均成立，视为反应结果符合。PCR无扩增或扩增片段大小不符合，判定为鲁氏耶尔森氏菌阴性。若扩增处出现587bp阳性扩增带，且扩增产物的序列与GenBank中鲁氏耶尔森氏菌的序列相似度98.0%,则需要按照第10章中所述，进行细菌分离和细菌初步鉴定，将符合11.3判定的疑似鲁氏耶尔森氏菌进行进一步的细菌PCR鉴定或生化鉴定确定。10细园分禺和培养用接种环将无菌操作采集的组织在TSA或BHIA上划线，于20T25°C培养48h-72h0菌落形态为圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、有光泽的乳白色半透明菌落,直径2mm3mm。11细菌初步鉴定11.1 革兰氏染色将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察。如观察到红色短杆状细菌，表明为革兰氏阴性菌。11.2 氧化酶试验在一载玻片上放一块滤纸片，然后用一滴蒸储水湿润纸片，再用接种环取单个菌落于上述湿的纸片上，最后在其上加一滴氧化酶试剂。若在1min2min不变色，表明该菌氧化酶阴性。11.3 结果判定革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性，菌体呈微弯曲的短杆状细菌，可判定为疑似鲁氏耶尔森氏菌，需做细菌PCR鉴定或生化鉴定确定。12细菌分离物生化鉴定对上述疑似鲁氏耶尔森氏菌进一步做生化鉴定，鉴定结果见表1»也可采用商品化的生化鉴定试剂盒按其说明书要求进行操作，或采用全自动微生物鉴定系统进行鉴定。表1鲁氏耶尔森氏菌生化特性表生化反应结果生化反应结果B-半乳糖昔+肌醇精氨酸山梨醇赖氨酸脱竣酶+鼠李糖鸟氨酸脱竣酶+蔗糖柠檬酸蜜二糖H2S苦杏仁甘尿素阿拉伯糖色氨酸脱氨酶氧化酶IIm朵产生硝酸盐还原V-P反应+25运动性+明胶麦康凯培养基生长+葡萄糖+氧化-发酵试验(O/F)+甘露醇+注："+"为结果阳性，为结果阴性。13综合判定13.1组织样品经PCR检测为阳性，且经过细菌分离培养，进一步生化鉴定或者细菌PCR鉴定，结果为阳性的，判定为鲁氏耶尔森氏菌检测阳性。13.2 分离菌经初步鉴定为疑似鲁氏耶尔森氏菌，经进一步生化鉴定或者细菌PCR鉴定，结果为阳性的，判定为鲁氏耶尔森氏菌检测阳性。13.3 组织样品经PCR检测为阴性，或未分离到细菌，或所分离到细菌的生化鉴定结果不符合鲁氏耶尔森氏菌特性的，均判定为鲁氏耶尔森氏菌阴性。附录A(资料性)鲁氏耶尔森氏菌简介A.1病原鲁氏耶尔森氏菌(YerSiniarUCkeri)是革兰氏阴性肠杆菌,该菌为微弯曲、大小在(L0m-2.0m)X(2.0m3.0m)的杆菌,靠7根8根周鞭毛运动，25°C培养有动力，37°C培养无动力。在胰蛋白月东大豆琼脂(TSA)或脑心浸出液琼脂(BHlA)培养基上于25°C培养48h72h可形成圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、有光泽的乳白色半透明菌落,直径2mm-3mm0A.2危害1966年首次报道该病原菌分离自美国爱达荷州哈格曼山谷的患病虹鳄(OnCorhynChUSmykiSS)。目前在北美洲、南美洲、欧洲、澳大利亚、南非、中东地区和中国等地都有报道。鲁氏耶尔森氏菌可感染多种鱼类，对能科鱼类影响特别明显，是造成能科鱼类肠炎红嘴病(EnteriCredmC)Uth,ERM)的主要病原菌。A.3临床症状被感染的鱼可以观察到异常的行为变化，包括在水面附近游动、食欲不振和异常游动(如竖游、旋游、倒游等)；患病鱼还表现出其他体征,如眼球突出、皮肤变黑、口腔和咽喉及其周围皮下出血、肛门红肿有异物流出等。鲁氏耶尔森氏菌侵染初期出现患病典型症状的鱼较少，感染后短时间内疾病大规模暴发，死亡严重。A.4地理分布在北美洲I、南美洲I、欧洲I、澳大利亚、南非、中东地区和中国等地均有分布。A.5易感宿主鲁氏耶尔森氏菌可感染多种鱼类，Si科鱼类影响特别明显。除了鞋鱼以外，鳗鱼(Anguillaan-guilla)×金鱼(CaraSSiUSaUratUs)、鲤鱼(CyPrinUSCarPio)、鲸鱼(ACiPenSerbaeri)、觞鱼(ICtalUrUSpunctatus)、鱼卢鱼(PerCafIUViatiliS)等也能被感染。附录B（规范性）试剂配制B.1胰蛋白月东大豆琼脂（TSA）胰蛋白月东大豆琼脂蒸储水20.0g500.0mL溶解胰蛋白月东大豆琼脂到蒸储水中，121°C高压灭菌15min,水浴冷却5（C,倒成平板，大约3mm厚,4保存。8.2 脑心浸出液琼脂（BHIA）脑心浸出液琼脂蒸储水24.5g1000.OmL溶解脑心浸出液琼脂到蒸储水中，121高压灭菌15min,水浴冷却50T,倒成平板，大约3mm厚,4。C保存。8.3 氧化酶试剂四甲基对苯二胺蒸储水将四甲基对苯二胺溶于蒸储水中,2OCC注：也能使用等效的商品化的氧化酶试纸条。1.0g100.0rL，5冰箱避光保存,在7d内使用。8.4 革兰氏染色BAl结晶紫染色液结晶紫95%乙醇1%草酸镀水溶液1.0g20.0mL80.0mL将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合。B.4.2革兰氏碘液碘碘化钾蒸储水1.0g2.0g300.0mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸储水少许，充分振摇,待完全溶解后，再加蒸储水至300mbB.4.3沙黄复染液沙黄95%乙醇蒸储水0.25g10.0mL90.0mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸储水稀释。B.4.4染色法涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液，作用1min,水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。滴加95%乙醇脱色15s30s,直至染色液被洗掉（不要过分脱色），水洗。滴加复染液,复染1min,水洗、待干、检。8.5 磷酸盐缓冲液（PBS）氯化钠氯化钾磷酸氢二钠磷酸二氢钾无RNaSe超纯水8g0.2g1.15g0.2g总体积1000rL将固体物质溶解于水，如果有必要，25°C时调节PH至7.3,121°C高压灭菌15min,冷却备用。8.6 蛋白酶K(PrOteinaSeK)工作液(100gmL)1×TNEBuffer10.0rL10mg/mL蛋白酶K原液0.1mL将100mg蛋白酶K加入IomL双蒸水中溶解，并在-20。C保存备用，使用时再配制成100mg/mL的工作液。B.7消化缓冲液100mmol/LNaCLlOmmol/LTris-HCI（pH8.0）,0.1molLEDTA（pH8.0）,0.5%（质量浓度）SDS,4保存。8.8 酚/三氯甲烷/异戊醇用LOmoI/LpH7.9±0.2Tris饱和酚:三氯甲烷：异戊醇按25:24:1的比例混合，密闭避光保存。8.9 三氯甲烷/异戊醇将三氯甲烷和异戊醇按24:1的比例混合,密闭避光保存。B.10TAE电泳缓冲液（50倍浓缩液）Tris242.0gNa2EDTA2H2O37.2g加80OmL蒸储水充分搅拌溶解后，加入57.1mL的乙酸，加蒸储水定容至100omL,室温保存。使用时用蒸储水稀释50倍即可。B.11EB（Ethidiumbromide,核酸染色剂）用灭菌蒸储水配制成Iomg/mL的浓缩液，用时每100mL琼脂中加10Lo附录C（规范性）扩增产物参考序列CGAGGAGGAAGGGTTAAGTGTTAATAGCACTGAACATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaaTtactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaActtgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaGgtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcgcccccctggAcaaagactgacgctcaggtgcgaaaggtggggagcaaacaggattagataccctggtagTccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaAcgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgGgggcccgcacaagcggtgaagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctACTCTTGACATCCACAGAACTTGGCAGAGATGCCTTGGTGCCTT（目的片段大小：587bp）