细胞外囊泡在检验医学领域的研究现状、挑战与发展趋势.docx

细胞外囊泡在检验医学领域的研究现状、挑战与发展趋势摘要细胞外囊泡（EV）作为疾病的新型生物标志物，在临床检验或疾病诊断和治疗中展现出广阔的应用前景。目前在EV分离技术、EV标志物筛选和验证、EV检测技术等领域均已取得重要进展，而EV真正走进临床实验室，还需要在多组学整合与大数据分析、临床适宜分离与检测技术开发、标准化与规范化质量体系构建、临床试验与产品监管审批等方面持续努力，从而促进EV检测技术在疾病诊断、疗效监测和预后判断中的应用和转化，推动检验医学更好服务人民健康。细胞外囊泡（extrace1.1.u1.arvesic1.es,EV）是一种几乎所有种类细胞均可分泌的纳米至微米尺寸脂质双层膜结构，由国际细胞外囊泡学会（Internationa1.SocietyforExtrace1.1.u1.arVesic1.es,ISEV）所定义，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体等多种类型1。作为细胞间物质交换、信息传递的载体，EV可携带蛋白质、核酸和代谢产物等生物分子稳定存在于血液、尿液、脑脊液等所有体液中，在机体的病理生理过程中发挥着重要作用，在疾病诊断、疗效评估和预后判断中展现出巨大潜力2o作为疾病生物标志物，EV具有以下独特优势：（1）无创性采集：EV广泛存在于各种体液中，采集过程通常无创，易于为患者所接受；（2）高度稳定性:EV的膜结构使其在体液循环中具有较高的稳定性，能够保护内部生物分子免受降解；（3）诊断灵敏性：病变细胞来源的EV在疾病早期阶段释放入血，具有早期诊断价值：（4）疾病特异性：EV携带的蛋白质、RA、DNA和脂质等多种生物分子反映其来源细胞的特异性，疾病的特异性较高。因此，基于EV的疾病生物标志物筛选及其检验新技术研究已成为检验医学领域的研究热点。一、细胞外囊泡在检验医学领域的研究现状（一）细胞外囊泡分离技术研究现状从复杂生物样本中分离EV是其下游分析和应用的基础，现有的EV分离技术主要包括超速离心法、尺寸排阻色谱法（SiZCexc1.usionchromatography,SEC）、亲和分离法、聚合物沉淀法和过滤法等"01 .超速离心法I纯度和回收率较高，可处理体积较大的样本，如细胞培养基或易获取的尿液样本等。然而，其操作爱杂、耗时长、需要昂贵的设备，且可能造成部分EV聚集和降解。特别是在黏度较高的样本基质如血浆中，离心过程中非EV生物分子的共沉淀，可能影响EV产量和纯度。因此，这种方法在临床检验广泛应用尚需突破第杂生物体液样本中低丰度EV亚群分离难的技术瓶颈,o2 .尺寸排阻色谱法I操作相对简便，不依赖复杂的设备，分离过程中对Ev膜结构无破坏性，可最大限度保持EV完整性，且由于上样量可调，广泛适用于不同类型的EV样品。然而对于较小尺寸的EV,由于其与部分可溶性蛋白具有相似粒径，分离过程中损耗较大。最新研究证实二分式尺寸排阻层析法（dSEC）可将曳杂的SEC多组份分离合并操作简化为一步洗脱，提升了SEC法的分离纯度和操作便捷性,其临床样本适用性尚需进一步验证03 .亲和分离法：可用于特定EV亚群的分离，以进一步研究其生物学特性、功能和分子组成。然而，抗体的选择可能限制免疫亲和富集方法的特异性，如果目标EV没有足够的特异性标记，或者抗体亲和力不佳，可能导致分离EV效率低。最新研究报道多肽探针可通过静电相互作用与富含磷脂酰丝冗酸的弯曲膜结合，实现多种样本类型的EV分离：脂质探针也可利用脂质分子插入EV脂质双分子膜的高亲和性，实现对血浆样本中EV的高效识别和捕获。以上新兴方法的临床转化应用仍需更多研究数据和结果的支持。4 .EV浓缩I主要通过聚合物沉淀法和过滤法来实现，可初步分离生物样本中EV,也可结合其他方法提高EV分离效率,1聚合物共沉淀法是通过降低溶质可溶性而从各种旦杂生物体液中沉淀EV的方法，操作简便快捷，不依赖于复杂仪器，且目前已有多种商业化试剂盒可供使用，技术难度较低。然而，共沉淀过程可能导致EV的膜结构破裂或蛋白质表面分子结构的改变，且产物纯度低，易混杂非目标蛋白质、核酸或其他颗粒，常需结合超速离心法、SEC等方法提高EV分离纯度。过滤法目前使用的是滤过膜和超声纳滤法，前者是利用不同孔径的过滤膜将EV与其他细胞、可溶性蛋白成分分离。例如，切向流过滤法通过使液体切向流经超滤膜表面，产生跨膜压力，将小颗粒和溶液推过滤膜，同时截留大颗粒，可有效降低样本内颗粒在滤膜上的堆积从而提高过漉效率。而超声纳滤法在传统过滤法的基础上通过负压振荡结合双耦合超声振荡系统作用于纳米超滤芯片上,可通过纳米孔快速去除游离核酸与蛋白等杂质，快速浓缩和富集样本中的EV,可实现自动化EV分离,相关商品化EV分离设备已经上市"咒然而，过滤法常常依赖于特殊的仪器设备，技术难度较高。（二）细胞外囊泡标志物筛选和验证利用生物标志物筛选是提高细胞外囊泡特异度和临床应用价值的有效途径。先进的蛋臼质组学、核酸组学技术的高速发展，使研窕者能够从EV中鉴定出成上万种生物分子，并利用快速发展的生物信息学工具和算法实现高通量生物分子数据的高效分析，发现和明确与各器官系统疾病相关的潜在生物标志物，探索这些分子在疾病中的作用及其相互作用网络。当前EV内的蛋白质和核酸标志物因其稳定性和相对成熟的检测技术，已成为标志物研究领域的新星，为疾病的早期诊断、病情监测和疗效评估提供了新思路.1.蛋白属标志物：EV所携带的蛋白质标志物已在恶性肿瘤、F1.身免疫性疾病、代谢性疾病及神经退行性疾病中进行了广泛的应用探索，并在临床应用中展现出独特的潜力。在恶性肿瘤中，EV蛋白质标志物有助于识别不同类型癌细胞及癌症进展。例如，在胰腺癌、前列腺癌和肝癌等肿瘤中,特定的EV蛋白质如PDkPSA.PTEN以及EpCAV等被发现与疾病活动相关。EV蛋白质标志物在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮和Sjdgren综合征中显示出诊断和监测的优势。系统性红斑狼疮患者中EV表达高水平的免疫球蛋白和补体成分，有助于评估疾病的活动性和严重性。在代谢性疾病中，EV蛋白质标志物能反映肝脏和肾脏的代谢功能状态，可协助非酒精性脂肪肝病和糖尿病等疾病的诊断。特别是在非酒精性脂肪肝疾病中，EV特定蛋白标志物(如CD14和CD16)可用于评估肝纤维化的严重性。在神经退行性疾病中，EV蛋白质标志物在疾病早期诊断和监测中也显示出重要的潜力。如阿尔茨海默病患者的EV携带B淀粉样蛋臼和Tau蛋白等与神经病理进展密切相关的蛋白质f"»2.核酸标志物：当前EV内的核酸标志物主要见于肿瘤领域，同神经退行性疾病、药物代谢检测等也有报道。核酸类标志物，特别是miRNA和其他RNA,已被证明在癌症早期诊断和监测中具有潜力。MOMEN-HERVI和ZAYAKIN课题组研究发现，特定的SnRNA(SN0RD3H和SN0RD1C)和InCRNA(1.nc-IFT122-2和1.nc-GSR-2)在乳腺癌患者和健康个体血液来源的EV中表达水平存在差异，可用于识别癌症患者；部分核酸标志物如miR-224-5p和miR-200h-5p等在癌症术后水平显著下降，提示它们可能来源于肿瘤组织：另外，特定RNA标志物还与患者的性激素受体状态和HER2表达相关，有助于进一步了解肿痛的生物行为变化SMo本期高玉婷等31报道了血浆外泌体中InCNORAD的表达上调与多个临床病理特征相关，具有成为膝胱癌诊断标志物的潜力：莫燕萍等f研究发现了非小细胞肺癌患者血清EV中2'OmC-miR-21-5p水平显著升高，2'On1.e-miR725a-5p水平显著降低，二者联合检测具备作为NSC1.C患者辅助筛查分子标志物的潜能。在药物代谢研究中，EV中的RNA可用于了解身体机对药物的反应”"，例如通过分析EV中特定miRNA表达可以用于评估抗癌药物疗效和患者是否耐药。除此之外，研究发现EV内RNA变化与神经退行性疾病也具有相关性，特定的miRNA和其他小RNA可能与发病机制相关，为有望成疾病早期诊断和治疗可能的靶点C似（三）细胞外套泡标志物检测技术研究现状发展适宜的EV标志物检测技术是EV进入临床应用的关键环节。目前，针对蛋白质、核酸等EV常见标志物有多种技术可供选择，可根据标志物的特征选择适宜的检测技术。1 .细胞外妻泡蛋白检测技术（1）蛋白质免疫印迹：是最常用的EV蛋白定性表征技术。然而，蛋白质免疫印迹所需EV样品量大、操作繁琐、实验流程长，限制了其在临床检验领域的应用o（2）胸联免疫吸附测定法：是一种常用于EV蛋白定性或定量分析的免疫检测方法，具有操作简便、经济实用、易于标准化、特异性强等优势。由于EV的异质性，所用捕获抗体没有统一标准，使用不同捕获抗体的酶联免疫吸附测定法检测相同EV蛋白结果的可比性较差12,1。（3）流式细胞术：通过荧光标记目标抗体或荧光探针结合EV表面特定蛋白质，经流式细胞仪检测。而获得定性或相对定量信息，微珠捕获EV是一种较常用的流式检测策略。此外，纳米流式细胞术突破了传统流式分析仪检测粒径的极限，将检测灵敏度提高至40nm,不仅具备单EV分析能力,还可实现EV表面蛋白标志物的多参数检测,有望成为临床实验室单个EV分析的适宜检测平台。本期胡芸芸等的综述介绍和总结了纳米流式的技术原理、产业转化及其在临床诊疗研究中的应用，并展望了该技术在囊泡研究和应用领域的未来趋势。（4）质谱技术：由于分辨率高、通量高、不受抗体限制等特点已逐渐成为EV蛋白质组学的主要研究手段。其中，非靶向蛋白质组技术用于EV蛋白质全面分析和新型蛋白标志物的发现；靶向蛋白质组技术主要用于多个EV蛋白标志物同时定量检测，检测通量高于流式细胞术。但质谱技术样品处理熨杂，耗时长，需要专业技术人员进行数据分析，结果存在一定的误差和不确定性，因此需要结合其他技术进行验证J。（5）液滴微流控技术：是基于油-水两相不相容的原理，用油相将连续的水相反应体系分割成离散的液滴反应单元，被广泛应用于单分子或单颗粒数字化检测E1.近年来，液滴微流控技术为特异膜蛋白表达呈阳性EV检测提供了新的单囊泡分析平台。该技术利用微米级的液滴包裹纳米级的EV进行分析，将不受EV粒径不均一的影响，可实现EV粒位全覆盖检测，并且已转化为单囊泡自动化检测设备，正处于注册前性能测试阶段，有望为临床样本的EV快速检测提供技术平台（6）生物传感技术：是一种能够通过酶、抗体、核酸等合适的生物识别元件，使其与目标靶分子发生特异性识别，触发一系列的生物反应，进而将其浓度信号转化为可观测输出信号的定量检测方法,可对EV携带的低丰度特异蛋白标志物进行高灵敏检测，有望成为疾病早期诊断的工具S1.2 .细胞外囊泡核酸检测技术(1)实时荧光定量PCR法：是目前最常用的EV核酸检测方法,可用于EV中miRNA,mRNA、IncRNA.CirCRNA、DNA等多种类型核酸分子的定量检测，定目前EV临床样品检测中应用最广泛的核酸检测技术t2°1O(2)数字RCR(digita1.PCR,dPCR)：是利用微流控技术将核酸靶标随机分配到大量相互独立的反应单元中，可实现EVDNA及RNA的绝对定量分析。与传统的荧光定量PCR相比，dPCR的检出限更低，并且对于微小差异的鉴别能力优于荧光定量PCR。近年来，dPCR技术逐步用于稀有EV核酸标志物检测中，有望进一步推动基于EV的疾病早期诊断技术的发展a1.o(3)基因芯片：是将特定寡聚核甘酸探针固定在芯片的每个预设区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而在一张芯片上同时对多个样本进行高通量基因检测。目前在Ev领域，其主要应用于EV标志物开发，尚无针对临床应用开发的EV检测芯片，(4)二代测序技术：可实现EV所有核酸片段的高通量测序分析,适用于核酸标志物的发现与筛选。国内多家单位也已应用NGS直接从体液EV中成功筛选出标志物并开展了临床试验。然而，大规模的测序数据往往需要复杂的数据分析流程，成本也远远高于常规检测技术C30二、细胞外妻泡在检殴医学领域的应用挑战（一）细胞外囊泡标志物的临床诊断效能仍有待进一步验证1.研究设计和样本量的局限：尽管已有研究表明EV在癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等方面具有重要的诊断和预后价值，但多数EV标志物研究尚处于初步探索阶段，设计方案多为小样本量的单中心研窕，缺乏大规模、多中心、前瞻性临床试验的数据支持，样本量不足、临床样本份数不足或研究队列设计的局限性导致研究结果的统计学效能不高，难以提供具有说服力的临床证据。2 .不同研究结果的异质性较大：EV来源于不同类型的细胞，异质性较高，且不同实验室采用的分离和检测方法不统一，导致研究结果的可重复性和可比性不理想.一些研究可能在某些疾病中发现了特定的EV标志物，但在其他研究中却未能重受这一结果，是EV走向临床面临的难题3 .诊断特异性验证不足I目前，尽管国内外研究者已发现许多潜在的EV标志物，但许多EV标志物在不同疾病中的表达模式未得到充分验证，其具体生物学功能和在疾病中的作用机制尚未完全阐明，缺乏足够的支撑数据。例如，一些EV中的蛋白质或RNA分子可能在多种类型的癌症中均有表达，难以作为某种特定疾病的特异性标志物,限制了EV在疾病精确诊断中的应用SJo（二）细胞外囊泡检测技术的临床检测性能评价不完善1 .临床样本处理的标准化问题：临床样本的处理过程（如采集、储存、运输和前处理）对EV分离和检测结果影响较大，但目前缺乏统一的标准操作规程。样本处理过程中的变异性增加了检测结果的不确定性，是EV标志物走向临床应用面临的那题之一。2 .EV分离技术与检测技术性能的局限性IEV分离技术种类繁多，各种技术工作原理、回收率和分离富集效率差异较大，且评价标准不统一，导致结果的可比性差。现有的EV检测方法的敏感度和特异度尚难以检出低丰度水平特异EV.亚群标志物，也不能区分不同来源的EVoEV在早期疾病诊断和精准医学中的应用还有较长的路要走。3 .数据分析和结果解读的复杂性：EV携带多种生物分子，对其进行多组学精准检测的数据量大且复杂，数据分析和结果解读需要高水平的生物信息学支持，但目前相关工具和标准化流程尚不完善，增加了检;则方法的操作难度，在临床推广应用还有待相应的技术和能力的创新突破与普及提升。三、细胞外素泡在检验医学领域的发展趋势（一）多组学整合与大数据分析作为亚细胞尺度的标志物载体，Ev携带蛋白质、RNA、DA和代谢物等多种生物分子，利用多组学整合对不同类型标志物的联合分析,借助基础研究与临床积累的大数据和人工智能解决红杂数据分析的技术难题并构建多维度疾病预测、诊断模型，不仅可以从高通量多维度组学数据中挖掘EV中潜在的标志物，预测其在不同疾病患者群体中的诊断价值，还能揭示传统方法难以发现的生物学特征，从而显著提高EV标志物的诊断特异性和灵敏度，是EV未来的发展方向和应用前景。（二）临床适宜的EV分离与检测技术开发随着交叉医学:的飞速发展，纳米技术、微流控技术、超分辨显微技术、功能材料和人工智能等新兴技术逐渐应用于EV的实验技术平介，显著提高了EV的分离效率.、检测试敏度和特异性。例如，超声纳滤技术结合了超声波和纳滤膜的优点，能够在短时间内高效纯化EV,适用于大规模临床样本检测”的：超敏流式细胞术和液滴微流控技术可以实现单个EV的高灵敏检测：超分辨率显微镜用于EV亚群表征以及与细胞互作分析画丁而由于体液样本的复杂性、EV标志物的多样性和高度异质性，应从EV走进临床尚需EV分离与检测自动化分析平台、单个EV高精度检测平价和多标志物高通量检测平台3个方向入手。进一步创新和优化EV分离与检测技术，以提高检测灵敏度和特异性、缩短检测时间、降低检测成本，方能推动EV大规模临床筛查和研究，使得EV分高和检测真正成为适宜技术，为健康管理，疾病预测、早期诊断、病情判断、治疗指导和疗效监测提供更优的技术手段或临床应用工具。（三）标准化与规范化质量体系构建完善的质量控制体系对于保证检测结果的可靠性和一致性至关重要，参考物质制研和质量保证体系的建立是核心。首先，标准化和可重豆性、物理化学特性稳定、生物学特性明确、可量化和易于获取等是EV参考物质必须达到的特性，也是EV研究的首要目标。其次,EV检测过程涉及从样本采集与处理、EV分离、检测和数据分析等诸多步骤，每个环节都可能引入误差和变异，影响结果的准确度。为此，ISEv和中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会（CSEV）制定了一系列立场性文件和质量控制程序，用于监测和控制EV检测的误差和变异。例如，ISEV发布的EV研究最新指南M如EV2023基于最新的科学进展和专家共识，提供了详细的实验操作和数据报告规范；开发M1.B100d-EV质量控制报告框架，涵盖血液样本详细的预分析变量和质量控制方法，以促进EV研究的标准化和跨实验室比较。CSEV已发布我国首批干细胞来源EV团体标准和细菌来源EM研窕的立场性文件他”K，本期发表的细胞外囊泡分离与检测技术专家共识W围绕EV定义与命名、样本收集与前处理、EV分离技术、EV检测技术4个基本问题川，形成了9条专家建议，以期进一步规范和标准化EV研究，提高研窕结果的可重熨性和可靠性。（四）临床试改与监管审批随着EV组学技术和分离检测技术的发展，大量EV候选标志物被发现，多种EV检测技术待临床验证，因此，与之相关的大规模、多中心、前瞻性临床研究逐渐增多，以评价其在不同疾病中的诊断效能。检索CIiniCaITriaIS网站,迄今有约450项与外泌体和EV相关的临床研窕，其中40%聚焦于临床诊断，以确定EV标志物及其检测技术与疾病诊断、预后评估和治疗反应之间的关联，判断EV标志物是否可纳入临床决策。随着EV标志物检测技术研究的不断深入，各国监管机构逐步完善了相关审批框架。例如，美国食品药品监督管理局（FDA）发布了一系列针对液体活检和EV标志物的指南文件，明确了临床试验设计、数据提交和审批流程的具体要求，20据年,ExoDxProState获得了美国FDA的监管批准，成为首个基于外泌体RNA的前列腺癌风险评估工具根据我国医疗器械监督管理条例，EV生物标志物检测产品属于体外诊断试剂的第二类或第三类，监管审批流程较为严格，涵盖了从研发、临床试验到产品检验和现场考核的各个环节。目前，国内已经有基于外泌体的卵巢癌体外诊断试剂盒获中国国家药品监督管理局批准上市，然而EV检测技术产业转化仍然任重道远。四、总结2013年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯-E.罗斯熨和兰迪-W.谢克虹、德国科学家托马斯-C.苏德霍夫，以表彰他们发现细胞内部囊泡运输调控机制，这也掀起全世界范围内关于EV的研究热潮。作为一种新兴的生物标志物，EV在检验医学领域展现出了极其广阔的发展前景。在国内大批EV研究者的共同努力下，我国Ev标志物检测技术的研究与应用与国际高度接凯，有望成为检验医学新质生产力发展的重要动力。而EV真正走进临床，成为诊疗工具段，还需要在多组学整合与大数据分析、分离与检测的临床适宜技术开发、标准化与规范化质量体系构建、临床试验与监管审批等方面持续努力。EV独具的性能优势，加上快速发展的配套技术，经过科学工作者和临床医生、检验人的不懈努力和探索，人们期待的EV将在未来以其卓越性能服务临床诊断和治疗，更好地为人类健康服务。