钩端螺旋体菌苗制造及检定规程冻干皮内注射用卡介苗制造及检定规程.docx

钩端螺旋体菌苗制造及检定规程本品系用各地区主要的钩端螺旋体流行菌型，经培育、杀菌后，按型别配成单价或多价菌苗，用于预防钩映螺旋体病。1菌种1.1 菌种来源制造菌苗用之菌种，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。疫情需要时,新分离的菌种经与质量检定部门会同检定符合规程要求，并经中国药品生物制品检定所同意后方可用于生产。1.2 菌种检定。生产用的菌种应通过体重120220g的豚鼠传代，23天后或濒死前抽取心血或摘取肝组织，接种生产用养基或其他适宜的培养基，并培育传至4代以上即可进行各项检定。1.2.1 培养特性将上述菌种搁于生产培养基，接种量在5%以下，2832°C培育510天，钩端螺旋体菌数应达每视野100条/40OX以上。培养物应透明，微带乳光，摇动时稍有云雾状混浊，菌形要求整齐，运动活泼，两端形成钩状。1.2.2 血清凝集反应用310天的活培养物，每视野50100条400x,运动良好，且无自凝的钩端螺旋体，与特异性血清做定量凝集反应，其凝集效价应达血清原效价之半。终点效价以菌数减少50%(+)为判定标准。新菌种要求用凝集素交叉吸收试验法定型。1.2.3 毒力试验用体重180220g的健康豚鼠6只，分成两组，弱毒、强毒株分别各皮下注射培育510天，每视野50100条/40OX活培养物2m1.。弱毒株注射后48小时抽取心血,按1%量接种于生产培养基或其他适宜培养基2支,培育14天,镜检。要求培育全部阳性，判为合格。强毒株注射后，观察10天，至少应有2只豚鼠因患钩端螺旋体病死亡，判为合格。1.2.4 免疫力试验用培育510天每视野70100条/40OX经5658加温1小时或03%（m1.m1.）苯酚杀死的钩端螺旋体培养物，以生理盐水做3倍稀释，免疫体重12022Og健康豚鼠3只（对照组3只应同时饲养）,皮下免疫2次,第1次05m1.,第2次Im1,间隔5天，末次注射后1012天用同株或同型异株培育510天每视野50100条/40OX的培养物2m1.进行皮下攻击。强毒株：攻击后观察10天，免疫组豚鼠应健存，外观及食欲正常，不耸毛，运动活泼，体重增加，解剖无黄疸。对照组豚鼠至少应有2只患钩端螺旋体病死亡，判为合格。弱毒株：攻击后，24小时抽取心血，接种2管5%8%兔血清培养基，每管12滴（约为1%接种量）。培育14天。免疫组心血培养要求2/3以上为阴性，对照组均为阳性，判为合格。1.2.5 抗原性试验用培育510天每视野70100条/40OX经56加温1小时杀死的培养物，静脉免疫体重2.02.5kg的健康家兔3只，各按Imh2m1.与5m1.,共注射3次，间隔5天，末次注射1015天取家兔血清与同株培养物作凝集反应，至少应有2只家兔血清效价达到1：100OO以上判为合格。1.3 菌各保存1.3.1 钩端螺旋体菌种应保存于含兔血清培养基或其他适宜培养基内，存放在1822暗处，定期传代保存或液氮保存。1.3.2 为保存菌种的毒力及纯度，每传36代，应通过体重12022Og健康豚鼠一次，并同时做血清学特性检查。2菌苗制造制造菌苗用的菌种每型可包括13株。2.1 菌种用体重120220g的健康豚鼠，皮下注射培育510天生长良好的种子培养物2m1.,注射后23天或濒死前抽取心血或摘取肝组织，按1%以下量接种于生产用培养基或其他适宜的培养基，2832。C培育718天，个别不易生长的菌种可延至30天，经检查为生长良好，运动活泼的纯培养，方可用于大量接种。此外洗种法也可使用。液氮保存菌种复苏后即可用于生产。第1代菌种须做纯菌试验及血清学特性检查。前5代接种量均不应超过10%-制造菌苗所用之菌种不应低于4代(洗种法除外)，最多不超过菌种检定许可的代数(从感染动物或复苏后接种第1代算起)。2.2 培育2.2.1 生产用培养基可用综合或半综合培养基。用IO1.大瓶或大罐通气培养时，经2832培育514天，菌数应达300条/40OX以上。取样作纯菌试验及镜检，应无杂菌。培养物可用适当的方法浓缩。2.2.2 培养物用苯酚或其他适宜杀菌剂杀菌。苯酚含量为0.25%0.35%(gm1.)o2.2.3 加苯酚的菌液于配合后，混匀，至少放置30分钟，取样镜检菌体灭活情况，测苯酚含量。大瓶培养应逐瓶做无菌试验。2.3 菌苗配制2.3.1 杀菌后，按预定比例将不同菌型培养物混合成1批。大罐培养亦可先合并后杀菌。若移至大瓶存放，应按前、中、后抽样做无菌试验。菌液如放置放半年以上。合并前应逐瓶重做无菌试验。2.3.2 菌苗所含菌型应按当地主要流行菌型配合，5价以下(含5价)者,每型含菌数不低于1.5亿条/m1.,各型配合比例，不应超过或低于计算量的10%o六价以上菌苗，每型含菌数不应低于1亿条/m.1.,但菌苗的总菌数不应超过12.5亿条/m1.。2.3.3 菌苗中应加氯化钠，使其最后含量为0.75%09%(gm1.)°2.4 菌苗分批同日合并的菌苗作为1批。大罐混合者，每罐作为1批，并按分装机分为亚批。2.5 分装分装后按亚批抽样，送质量检定部门检定。3成品检定3.1 物理化学检查应为微带乳光的液体，不应变色，无异臭，无摇不散的凝块及异物。PH值应为6.47.4。氯化钠含量应为0.75%0.9%(gm1.)0苯酚含量不超过0.25%0.35%(gm1.)o3.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.3 安全试验3.3.1 防腐剂试验用体重1820g健康小白鼠2只，各皮下注射0.5m1.,注射后战栗不得超过半小时，观察7天，应活存。局部不得有脓肿或坏死。3.3.2 毒性试验用体重1820g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗05m1.,或用体重35045Og之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗0.5m1.,观察7F1.,应无死亡。3.4 免疫力试验按成品菌苗所含菌型价数检定，用生理盐水将菌苗稀成每型含菌数0.5亿条m1.o每生产年度生产前3批均匀应做免疫力试验，以后每5批至少抽检1批。试验方法与判定标准同1.2.4项。3.5 鉴别试验采用反向间接炭凝集试验，按成品菌苗所含菌型价数与相应炭血清做炭凝集试验，应产生特异性凝集。4保存与效期应保存于28暗处，自杀菌之日起效期为1年半。钩端螺旋体菌苗使用说明书本品系用不同型别之钩端螺旋体菌株分别培育杀菌后，按各地流行菌型配成单价或多价菌苗。用于预防钩端螺旋体病。本品为白色微带乳光的液体，含苯酚防腐剂，不应有摇不散的凝块及异物。接种对象流行地区7至60岁的人群。应在流行季节前完成注射。用法1.上臂外侧三角肌附着处皮肤经消毒后皮下注射。2.剂量：第1针0.5m1.,第2针1.onI1.,间隔710天。713周岁用量减半。必要时，7周岁以下儿童酌量注射，但不超过成人量之1/4。1.发热，急性传染病，严重心脏病，高血压，肝、肾脏病，神经和精神疾病。2 .孕妇，哺乳期妇女。3 .有过敏史者。4 .月经期暂缓注射。反应全身及局部反应一般轻微，偶有发热及局部疼痛、红肿。注意事项1.安甑内有摇不散的凝块、异物或菌苗变色，曾经冻结，安甑有裂纹等均不能使用。5 .应备有1：100O肾上腺素，供偶有发生休克时急救用。保存保存于28暗处。冻干皮内注射用卡介苗制造及检定规程本品系卡介菌经培育后冻干制成。用于预防结核病。1菌种1.1 制造卡介苗的菌种，应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。严禁使用通过动物的菌种制造卡介苗。1.2 如果采用次代种子批，单批收获培养物的总代数不得超过12代(包括在马铃薯培养基上培育的代数与在液体苏通培养基上的代数)。1.3 菌种检定新收到的菌种或新制备种子批应进行下列检定。1.3.1 培养特性卡介菌在苏通培养基上发育良好。培育温度在3739之间。抗酸染色应为抗酸杆菌。在苏通马铃薯培养基上发育的卡介菌应是干皱成团略呈浅黄色。在牛胆汁马铃薯培养基上为浅灰色粘膏状菌苔。在鸡蛋培养基上有突起的皱型和扩散型两类菌落，且带浅黄色。在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱微带黄色的菌膜。1.3.2 毒力试验用结素试验(PPD100IU)阴性，体重30040Og的同性健康豚鼠4只，各腹腔注射ImI菌液(5mgm1.),每周称体重，45周后解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结及脾可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的病变。1.3.3 毒力试验用结素试验(PPD100IU)阴性，体重300400g的同性健康豚鼠6只，于肌内侧皮下各注射ImI菌液(10mgm1.),注射前称体重，注射后每周观察1次注射部位及局部淋巴结的变化。每2周称体重1次。6周时解剖3只，满3个月将另3只豚鼠解剂，检查各脏器应无肉眼可见的结核病变。若有可疑病灶时,应作涂片和组织切片检查，并采取部分病灶磨碎，加少量生理盐水混匀，皮下注射2只豚鼠。若证明系结核病变，该菌种即应废弃。试验经过详细记录备查。若未满3个月试验豚鼠因其他病患死亡应解剖检查，依上法处理。若死亡2只以上应重试。1.3.4 免疫力试验用原代种子批以1/100人份的剂量免疫豚鼠，以103104强毒人型结核分枝杆菌感染，免疫组与对照组动物的病变指数及脾脏毒菌分离数的对数值经统计学处理，应有显著差异。如无条件，可送中国药品生物制品检定所进行。1.4 菌种保存冻干菌种保存于28。2菌苗制造2.1 卡介苗制造室必须与其他生物制品部门及实验室分开。所需用具如高压锅、冰箱及玻璃器皿等，均须单独设置并专用。卡介苗制造、包装及保存过程均须避光。卡介苗制造的工作人员及经常进入卡介苗制造室的人员，必须身体健康，经X线检查无结核病，且以后每年经X线检查12次，可疑者暂不在卡介苗制造室工作，其检查记录必须保存备查。2.2 制造用培养基生产用培养基不得含有能使人产生毒性或变态反应的物质。培养基所用的原料应符合中国生物制品主要原材料试行标准规定。2.3 菌种传代与培养冻干菌种在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基以及液体苏通培养基上每传一次为一代。马铃薯培养基上培育的菌种放冰箱保存不超过2个月。用于生产菌苗的培养物的总代数不超过12代。2.4 原液制造2.4.1 收集培养瓶应逐瓶检查，若有污染、湿膜、混浊等情况应废弃。收集菌膜压干,移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨。加入适量无致敏原保护液稀释成一定浓度的原液。2.4.2 稀释用中国药品生物制品检定所发给的冻干卡介苗参考比浊标准，以分光光度法或其他适宜方法测定原液浓度，用保护液将原液稀释成1.omg/m1.。2.4.3 纯菌试验用于制造卡介苗的培养物、原液、以及稀释后的菌苗均应按生物制品无菌试验规程抽样做纯菌试验。2.5 菌苗分批用同一代菌种同时制造的菌苗为1批，稀释为数瓶者，按瓶分亚批。2.6 分装分装过程中勿使苗混合均匀。每10人份卡介苗应为05±01.mg03冻干菌苗原液分装后应立即进行冻干。干燥完毕后立即进行真空封口。亦可充氮封口。4成品检定4.1 物理化学检查冻干卡介苗应为白色疏松体或粉末状。加入稀释液后，应于3分钟内完全溶解成均匀悬液。残余水分不应超过3%。包装前应每支安甑检查真空，不合格的安甑应废弃。4.2 鉴别试验每批菌苗须做涂片检查，抗酸染色应是抗酸杆菌。4.3 纯菌试验每亚批菌苗抽样按生物制品无菌试验规程进行。4.4 活菌计数同一代菌种制造的各批冻干卡介苗应抽1批做干前活菌计数。同一批菌种制造的各亚批菌苗均应做干后活菌计数，抽安甑5支稀释混合。冻干菌苗活菌数应在100万mg以上。可与热稳定性试验同时进行。4.5 热稳定性试验取冻干后菌苗放置3728天进行加速失活试验，测定活菌数，与4保存的同一批菌苗同时进行比较，计算降低的百分离。加温放置制品的活菌数应不少于冷藏菌苗的2%,但不得低于20万/mg。此试验可与参考菌苗同时进行(参考菌苗加入试验的目的为检查培养基的质量)。每一机柜冻干菌勒应抽样进行此项试验。4.6 安全试验同一代菌种生产的各批冻干卡介苗应抽1个亚批做安全试验。用结素试验(PPdIOIU)阴性，体重30040Og的同性健康豚鼠6只。每只皮下注射相当于50人份的冻干皮内注射用卡介苗，每2周称重一次，观察6周后，解剖检查每只动物，若肝、脾、肺等脏器无结核病变，该批菌苗即可发出使用。若有可疑病灶时，应按1.3.3项处理。5保存与效期保存于28暗处。自首次活菌计数结束之日起效期为1年。冻干皮内注射用卡介苗使用说明书严禁皮下或肌内注射本品系卡介菌经培育后冻干制成。用于预防结核病。本品为白色疏松体或粉末，按规定量加入稀释液后，应于3分钟内完全溶解成均匀悬液。接种对象出生3个月以内的婴儿或用51UPPD或51U稀释旧结核菌素试验阴性的儿童（PPD或结素试验后48-72小时局部硬结在5mm以下者为阴性）。用法1.菌苗稀释用灭菌的Im1.注射器将随制品附发的稀释液定量加入冻干皮内注射用卡介苗安甑中（）稀释液应有足够的附加量，以保证吸出量与标示量一致），放置约1分钟，摇动安甑使之溶化后，用注射器来回抽取数次，使充分混匀，每支安甑自稀释时起，必须在半小时内用守，以防污染。2.接种方法先用75%酒精消毒上臂外侧三角肌中部略下处的皮肤，然后用灭菌的Im1.蓝心注射器（2526号针头）吸取摇匀的菌苗，皮内注射S1.m1.反应接种后2周左右，局部可出现红肿浸润，若随后化脓，形成小溃疡，可用1%龙胆紫涂抹，以防感染。一般812周后结痂，如遇局部淋巴结肿大可用热敷处理，如已软化形成脓疱，可用灭菌注射器抽脓。如已穿孔，则请医生检查，可用10%磺胺软膏或20%对氨基柳酸软膏处理。林己东标凡患有结核病、急性传染病、肾炎、心脏病、湿疹、免疫缺陷症或其他皮肤病者均不予接种。注意事项1.安甑有裂纹和过期失效者不可使用。2 .接种对象必须详细登记姓名、性别、年龄、住址、菌苗批号及亚批号、制造单位和接种日期。3 .接种卡介苗的注射器应专用，不得用作其他注射，以防止产生化脓反应。4 .使用时制品注意避光。保存保存于28暗处。