花生疮痂病菌毒素（ESC）对寄主细胞程序性死亡机制研究.docx

花生疮痈病菌毒素(ESC)对寄主细胞程序性死亡机制研究研究内容和意义花生.(Arachishypogaea)是我国主要的经济作物和油料作物，种植面积位列世界第二位,总产量:居世界第一.近年来，花生疮痂病(SPhaee1。IaarachidisBitaucourtetJenkinS)危害越加严亚，导致我国福建、山东和辽宁等主要花生产区大面枳减产，一般病IH减产IO%3O%,严重田块损失可达50%以上。花生疮痂病为近年来新流行病害,在寄主与病菌互作等方面尚未见研究报道，研究基础薄弱，无法诠粹病菌与寄主之间的互作机制，阻碍了该病害的深入研究及后期的抗病育种、新型安全防控技术的开发。本项目以花生疮痂病菌为研究对象，深入开展花生疮痂病菌毒力因子筛选、南素在致病中对寄主植物损伤和细胞凋亡作用及其作用机制等研究工作，明确花生疮痴病菌毒素(ESC)的毒力作用及其在病原菌-植物互作过程中的地位，结合申请人前期对辽宁花生疮痂病侵染过程和流行因素的研究基础，不仅能鲂完善花生疮痂病的致病机制的理论探讨，同时对于我省花生产业的健康发展和农民增收具有重要意义，为后期抗病育种和新型防控技术研究提供理论基础.已取得成果1 .已完成供试菌株和对照菌株分离纯化及病原学研究工作：课题组已完成对辽宁省,河北省,山东省，江,»省和广西省等主要产区菌株分离纯化。并获得柑橘疮痴病菌和彷荷黑豆病菌对照菌株。建立了病菌稀解单曲落分高及研磨快速扩繁体系，并对不同菌株的培养性状和致病性进行了初步研究，发现不同菌株间存在生长速度、形态和产毒的差异：完成已获得菌株的形态和分子鉴定工作。2 .花生疮痂病的毒素提取条件的初步建立：掌握从花生疮痂病菌中提取毒素的方法。菌饼干燥后于丙能中连续两次萃取6h后合并，旋转蒸发后用两酮溶解得到毒素提取液，用薄层色谱法进行鉴定。3 .筛选出抗感品科U明确接种条件：已完成辽宁主要花生品种的抗病性鉴定工作，筛选出白沙1016为高感品种，为病原菌及毒素的牛.测提供了试验材料，明确花生疮痂病菌及毒素的接种条件。4 .建立了白沙1016的细胞悬:浮体系：课题组通过组织培养技术，以白沙1016为试材初步建立细胞悬浮体系。愈伤诱导：MS添加1.5mg1.24D1.Omg,1.KT+3.0mg1.6BA:悬浮培养:MS液体添加2.5mg1.2.4-D+1.5mg1.KT+2.5g1.6-BA+30g1.蔗做。预期成果预期研究成果以技术体系、研究报告和发表学术论文的形式进行汇报。具体如下：(1)殂立一套适宜花生疮痂病菌致病机制研究的不同品种花生细胞悬浮体系：(2)明确花生疮掘病菌毒素在致病过程中对细胞膜的损伤和毒君作用：(3)探索毒素在花生疮痂病菌致病过程中的生理生化机制，分析活性氧在花生细胞程序性死亡和寄主-病菌互作过程中的作用及其机制：(4)明确活性氧淬灭剂对花生细胞渊亡的缓解或抑制作用及对病杏侵染扩展的防控机制。(5)发表研究论文2-3篇，其中Se1.论文1篇，培养研究生2-3人申请者学历和参加科研工作简历周如军，男,汉族，1979年10月生，博士，副教授,硕士生导师，现任沈阳农业大学植物保护学院植物病理教研室副主任,主要从事花生和药用植物真菌病害及病害流行教学和研究工作。兼任国家职业技能鉴定植保工和中药材种植员海级考评员。先后获沈阳农业大学优秀指导教师、吉年骨干教师和十佳青年教学科研向位能手等称号。2014年入选辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划.申请者发表或参与的主要论着目次和疆奖情况近年来的研究工作主要围绕花生主要病需传播动态和流行机制及安全防控技术、药用植物病害病原鉴定及监测等研究方向展开。在上述领域主持2009-2010沈阳农业大学青年教舞基金和启动基金2项，2013年主持辽宁省博士启动基金“花生疮痂病流行动态及其模拟模型的研尢(20131106)-I项，2014年主持辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划“花生疮加病侵染机制及其流行成灾关键因了研究2014056)”1项，参加国家自然基金、农业部公益性行业科研专项、科技支推计划、辽宁省自然基金和辽宁省农业攻关项目等7项。在P1.antDisease,Phytoparasitica,Myco1.ogica1.Progress,g植物病理学报机中国油料作物学报和植物保护学报等国内外学术期刊发表论文30余篇,其中SCI收录10篇，主编药用植物病害原色图鉴1部，副主编图说花生病虫害防治关键技术等著作4部，参编3部.先后获辽宁省政府科技进步三等奖2项，市厅级科技进步奖2项。I.周如军崔建潮,他俊范*,徐砧.佛彩公.花生褐斑病曲和网斑衲储混合侵染时侵染概率和潜育期的影响IJ.中国农业科学.2015,48(21).4264-4271.2. 何晶晶.周如军.崔健潮.徐砧.傅俊范.吴楠.不同杀菌剂对花生网现病菌室内毒力测定及小间防效研究国.中国油料作物学报,2015,37(4),525-531.3. 周如军.徐转,E大洲.杨风艳，修彩云，傅俊范.JX中花生褐斑病发生及时间流行动态模型研究.中国油料作物学报.2014.36(4):533-537.4. 周如军.徐枯，傅俊范,崔建潮，何晶晶，薛彩云.辽宁花生品种对超标病抗性及流行时间动态分析W.植物保护学报.2014,5(41):597-601.5. 周如军傅俊范.王大洲.杨风艳薛彩云.辽宁花生疮痂病发生调查及流行因素分析切.植物保护.2013(1):159-161.6. HaijiaoXu.RujunZhou.JunfanFu,YueYuan,Hongbo1.i.NingHao.Cha11ic(eriza(ionofSderoiinianiva1.ixcausingScIenHiniaroofPuhati1.1.ahtreanainChina.EuropeanJourna1.ofP1.an1.Patho1.ogy.2015,143(1):1-97. Yuan.YgRujunZhou.HaijiaoXuJunfanFutNingHao.Hongbo1.i.Occuenceofgrey1.eafspotofSedumeryihmsiiciumcausedbyCerCoSpomcf.pscudoka1.anchoesinChina.Journa1.ofPhytopatho1.ogy.2015,163(11-12):997-1001.8. Yang-HuiOu,RuJuZhou,Jun-FanFu,YueYuan,HaiJiaoXu.Puraccrcospord(Iic1.amniaf1.asp.nov.fromChina.Myco1.ogica1.Progress.2015.14（4）:15.9. Zhou,R.Xu.H.»C>u.Y.Hao,N.,Fu.J.Moipho1.ogica1.andmo1.ecu1.ari（Jemif1.cationOfPoWdery1.ni1.deWofCIcnM1.istmshuricacausedbyErysiphcaqui1.egiaeinChina.Phy1.oparasitica.2015.43（1）:15-19.10. Zhou,R.J.Yuan,Y.,Xu,H.J.,Fu,J.F.,Ou,Y.H.FirstreportofanthracnoseofMahasy!vestrhcausedbyCoUetotrichuniIrifo1.iiinChina.P1.antDisease,2014,98（11）:1587.申请者已完成或正在承担（负贵或叁加）省级以上（含省级）各类科研计划、基金资助项目情况（包括：项目名称、编号、来源、起止年月、进展等）（限制字数f500字）辽宁省博士启动基金项目“花生疮病病流行动态及其模拟模型的研究（20131106）”和辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目“花生疮族病侵染机制及其流行成灾关使因子研究<2014056）”项目。（I）、项目提出背景（【提示】相关领域国内外发展现状与趋势|我省现有技术基础I立题必要性；项目申报单位实施该项目的优势.限制字数：500字）花生.Srachishypogaea）是我国主要的经济作物和油料作物，种植面积位列世界第二位，总产量居世界第'o近年来，花生疮痂病（SPhaCeIomaarachidisBitaucour1.e1.Jenkins）危害越加严蓝，导致我国福建、山东和辽宁等主要花生产区大面枳减产，一般病因减产IO%3O%,严重田块损失可达50%以上。花生疮痂病为近年来新流行病害，在寄主与病菌互作等方面尚未见研究报道,研究基础薄弱，本项目以花生疮痂病菌为研究时象，通过对花生疮施病菌毒素对寄主损伤和细胞凋亡的作用及其在寄主病菌瓦作过程中的作用机制研究，明确花生疮痂病雨毒素（ESC）的傅力作用及其在病原菌-植物互作过程中的地位，为后期抗病育种和新型防控技术研究提供理论基础。课题组H前已完成供试的株和对照菌株分离纯化及病原学研究工作，并且初步建立了花生疮加病菌毒素提取的条件,在前期研究的过程中已完成辽宁主要花生品种的抗病性鉴定工作，筛选出白沙1016为高感品种,为病原菌及毒亲的生测提供J'试验材料，并初步建立J'白沙1016的细胞悬浮体系，为后续试验提供充足的材料。科学水平及意义花生疮痂病为辽宁省花生产区新爆发式流行性病害，发生区域广，严1R田块损失可达50%以上，已成为花生产业持续发展中亟待解决的植保问题。国内外对于花生疮痂病的研究基础较为薄弱，无法诠释病菌与寄生之间的互作机制,阻碍了该病害的深入研究及后期的抗病育种、新型安全防控技术的开发。本项目以花生疮痂病菌为研究对象，深入开展花生疮痂病菌毒力因子筛选、毒素在致病中对寄主植物损伤和细胞凋亡作用及其作用机制等研究工作，探索花生疮痂病菌与寄生的互作机制.研究过程中会建立花生细胞悬浮体系，并对各种因素进行优化,该技术为花生的遗传转化和功能基因转化提供材料和技术支持。另外，木研究中将会探讨淬灭剂等对花生疮痂病菌毒素的缓解和抑制作用，进而减轻病害的发生和流行程度，该部分研究结果对于寻找新型、安全的病杏防治方法提供了理论支持，对于花生减量使用农药具有重要意义。结合申请人前期对辽宁花生疮加病侵染过程和流行因素的研究基础,本项目的研究结果可以很好地解释近年来辽宁花生产区花生疮痴病爆发式流行因素和流行机制，不仅能够完善花生疮痂病的致病机制的理论探讨，同时对于我省花生产业的健康发展和农民增收具有重要意义。（3）、项目主要内容与指标【提示】主要研发内容；拟解决技术关健点及主要指标.限制字*t500字）（1）基于前期病原菌侵染过程研究基础，明确花生.疮痂病菌毒素对病菌侵染及病斑扩展的影响。在花生细胞悬浮系统中分别加入不同浓度的花生疮痂病菌毒索，通过相应的染色方法测定细胞死亡率和存活率，明确花生疮痴病菌毒亲在致病过程中对细胞膜的损伤和毒害作用。（2）利用细胞悬浮体系测定花生细胞程序性死亡过程中的,OsO以及FhCh三种不同活性氧种类及其含量，分析与细胞凋亡的关系，明确毒素对花生细胞凋亡的作用机制，分析活性氧在花生细胞程序性死亡和寄主-病菌互作过程中的作用及其机制。（3）测定花生.疮摭病菌年素对寄主防御酸的响应动态，确定毒素对寄主生理牛化的的影响,进步证明花生疮痂病菌毒素是否为花生疮痂病菌的毒力因子。探索福素在花生疮加病曲致病过程中的生理生化机制。（4）通过添加不同类型的活性氧淬灭剂，探索不同类型活性氧作用，进一步证实毒素在花生疮痂病菌致病中的主导作用，明确活性氧淬灭剂对花生细胞凋亡的缓解或抑制作用及对病害侵染扩展的防控机制。（5）发表研究论文2-3篇，其中SC1.论文1篇，培养研究生.23人。（4）、项目主要创新点【提示】主要创新点，以及覆期获得的研究成果简况.限IW字数：500字）（1）在花生疮痂病研究过程中，首次揭示花生疮摭病菌毒素为花生疮痂病的毒力因子，为花生疮痴病的致病机制的研究提供理论基础.（2）利用细胞悬浮培养技术在细胞膜和活性氧两个方面研究花生疮摭病菌毒素对寄主植物细胞的损伤及其诱导细胞程序性死亡过程，能够更加准确地阐述其作用机制。（3）通过添加活性氟淬灭剂探究其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒害作用，不仅能锅反向证明毒索是花生疮痂病菌的重要致病因子，而且研究结果能够为花生疮揄病的综合防治提供一个崭新的视角。«）、项目实籁的可行性（【提示】项目拟采取的研究方法（或技术路线、实施方案）的可行性何况.限制字数：500字）（1）花生疮痂病菌毒素对寄主损伤和铀胞漏亡的作用花生疮病病菌毒素对病超形成和扩展的影响，采用前期的接种方法，在不同的环境条件下，通过网格法测量叶面积，以浸染位点数计算侵染概率。花生疮病病菌毒素对例胞网亡的作用：在悬浮体系中添加毒素，通过荧光染色法检测细胞存活率，并进行DNA条带分析。（2）花生疮庭病毒素对寄主的胞宿亡作用机制研究花生疮痴病菌毒素对寄主防街屏的影响动态：通过测定植物防御能活性，确定在舟素浸染叶片的过程中寄主植物的生理变化及花生疮痴病菌毒素的作用机制.花生疮痴病菌毒素对寄主的胞质膜过气化和脂质过气化的影响：丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，膜破裂程度以电解膜渗透率为指标,探究毒素对细胞损伤的机制。花生疮痴病菌毒素对活性氧产生动态及细胞凋亡的作用机制，92采用DaubandHangarter的方法进行测定：O2用四喋怒城方法测定：FhCh采用Uchida等的方法。（3）淬灭剂对花生损伤和细胞凋亡的抑IM作用在毒素接种植株和细胞的不同时间添加胡萝卜素、半胱第酸等不I可活性乳泮灭剂，通过病斑大小和TTC染色法测定细胞活性，明确O2等活性氧在浸染中的机制。（6）、项目期目标与效果前景分析（【提示】项目期目标与效果（包括经济、社会、环境等）分析简况.限制字数：500字）（1）项H研究过程中花生细胞悬浮体系的建立和优化不仅仅对本项目的研究提供了便捷试验材料和条件，同时对于其他花生病害致病机制研究工作以及如花生品种资源保存、遗传转化和功能基因插入突变等等相关研究工作提供r技术平台（2）本项目采用细胞悬浮体系，从细胞膜损伤和氧化胁迫两个角度对花生疮揄病菌毒素在致病过程中的生理生化作用机制进行了深入研究，该研究结果对于花生疮痂病菌致病性后续研究深入研究工作提供了理论研究基础（3）本项目中通过添加活性氧淬灭剂探究其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒害作用，不仅能够反向证明毒素是花生疮痂病菌的重要致病因子，而且研究结果能够为花生疮痂病的综合防治和新型安全药剂的创制提供一个崭新的视角.ox项目坦主要成员研究能力与分工构成情况，以及正在承担（负责或参加）的省级以上（含省级）各类计划、基金资助项目情况（限制字数I50（）字）周如军（项目申请人），男，1979年10月生，副教授.现工作于沈阳农业大学植物保护学院，主要从事植物病害流行学和植物真病害教学和研究工作.傅俊急（项目指导），男，1958年10月生.中共党员，博士，教授，博士生导师.现任沈阳农业大学植物保护学院院长，兼植物保护一级博士点学科带头人，辽宁省植物保护一fi点学科带头人，辽宁省和农业部点学科植物病理学科带头人，辽宁省植物病理工点实验室主任，辽宁省植物免疫重点实验女主任，沈阳农业大学植物病害流行与药用植物病害研究室主任、辽宁省植物保护学会副理事长，中国植物保护学会理事，中国园艺学会小浆果分会常务理事，农业部农药登记田间药效试验杀三剂项目技术负责人等.牌彩云，女，1982年9月出生，讲师，主要工作为首株的分离纯化.赵杰锋，男，1991年8月出生，硕士研究生，主要工作为病菌分子签定.刘璐，女，1992年9月出生，硕士研究生，主要工作为毒索提取.李元杰，男，1991年11月出生，硕士研究生，主要工作为病分子鉴定.焦文莉，女,1993年11月出生，硕士研究生，主要工作为作用机制研究.施梦雪，女，1993年3月出生，硕士研究生，主要工作为病原学研究.（2）、承担单位现有研究仪器、设备情况，以及借助省皴以上（含省级）重点实殴室开展本项目研究的情况I限制字数：500字）课题组所属植物病理重点实验室依托辽宁省重点学科沈阳农业大学植物病理学科，设备条件先进.近年来沈阳农业大学快速发展，植物保护学科在此基础上建立了学科中心实脸平台，拥有PCR基因扩增仪（英国，Hybaid1.imited）,CFX96实时荧光定量PCR（美国Biorad公司），HeraeUS型高性能台式冷冻离心机（德国），GZP250型光照恒温培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器JD,Pro1.CaniI2IEF蛋白质双向电泳系统（美国Bio-rad公司）,DCodcSystemforDGGE梯度凝胶电泳系统（美国Biorad公司），ChCmiDOC-XRS化学发光凝胶成像系统（美国Bio-rad公司），Mi1.1.i-Qintegra1.IO超纯水一体化智能系统（美国MiI1.ipOre公司），台式高速冷冻忘心机（Eppcndorf58O4R）,超低温冰箱（SANYOMDF-U32V）,恒温光照培养箱（SANYOSGC660）及各式离心机、光谱仪和曲标仪等常规分子试验和生理生化试验仪器设备，能够满足本课题研究过程中所用仪涔和设备的需要。（3）、前期相关工作进展、以及研究时间及其他相关保证条件I限制字数：500字）1 .已完成供试菌株和对照菌株分离纯化及病原学研究工作：截止2016年底，课题组已完成对辽宁省，河北省,山东省等主要产区菌株分离纯化。并获得柑橘疮痂病菌和前萄黑豆病菌对照菌侏“建立了病菌稀释单菌落分离及研磨快速扩繁体系,并对不同菌株的培养性状和致病性进行了初步研究，发现不同菌株间存在生长速度、形态和产毒的差异：完成已获得菌株的形态和分子鉴定工作。2 .花生拉痂病菌毒素提取条件的初步建立（2016年3月-9月）：掌握从花生疮痴病菌中提取毒素的方法。3 .筛选出抗感品种，明幽接种条件（2015年3月2OI5年10月）：已完成辽宁主要花生.品种的抗病性鉴定工作，筛选出白沙1016为高感品种，为病原菌及毒素的生测提供了成验材料.4.建立了白沙1016的细胞悬浮体系（2016年7月-2016年12月）：课逐组通过组织培养技术，以白沙1016为试材初步建立细胞悬浮体系。项目Si期进度安排（【提示】注明8（期实Ji进度安排的初步计划（即阶段性工作要点）（限制字段：1000字）2017年3月2017年8月,优化花生细胞悬浮体系：利用花生疮摭病菌毒素对花生进行接种,明确其在侵染过程中对病斑扩展的影响：测定明确花生疯囊腔菌毒素在植物发病过程中生理生化等动态变化,进而为花生痂囊腔菌毒素致病机制的更深步研究做好研究基础，2018年1月.2018年12月：提取花生.疮痂旃菌毒素，并加入到花生细胞悬浮体系中，通过对细胞损伤的测定、细胞内内二醛的产生以及其产生活性氧对细胞的毒害作用的研窕，明确花生加囊腔菌毒素对细胞损伤及其使细胞膜过氧化的机制，探索其诱导细胞程序性死亡的的机制。参加国内外学术会议1次。发表学术论文12篇。2019年1月.2019年12月：花生疮痂病菌毒素对活性氧产生动态研究：活性氧在细胞凋亡过程中的作用机制：通过添加能使其失活的泮灭剂等试剂，明确淬灭剂对细胞损伤以及花生疮摭病的抑制作用，整理研尢结果，撰写结题报告，撰写研究论文1-2篇。