研究内容和意义花生 Arachish.docx

研究内容和意义花生（Arachishywgaea）是我国主要的经济作物和油料作物，种植面积位列世界第二位,总产量居世界第一。近年来，花生疮撷病（SPhaeek>iaarachidi$BitaucourtctJCnkinS）危害越加严重，导致我国福建、山东和辽宁等主要花生产区大面积减产，般病田减产10%30%,严重田块损失可达50%以上。花生疮痴病为近年来新流行病害，在寄主与病菌互作等方面尚未见研究报道，研究基础薄弱，无法诠释病菌与寄主之间的互作机制,阻碍了该病害的深入研究及后期的抗病育种、新型安全防控技术的开发.本项目以花生疮痂病菌为研究对您，深入开展花生疮痴病菌毒力因子筛造、毒素在致病中对寄主植物损伤和细胞凋亡作用及其作用机制等研究工作，明确花生疮痂病菌毒素（ESC）的毒力作用及其在病原菌植物U作过程中的地位，结合申谙人前期对辽宁花生拉痂病侵染过程和流行因素的研究基础，不仅能够完善花生疮痂病的致病机制的理论探讨，同时对于我省花生产业的健康发展和农民增收具有更要意义，为后期抗病白种和新军防控技术研究提供理论基础.已取得成果I.已完成供试菌株和对照菌株分值纯化及病原学研究工作：课甥组已完成对辽宁省，河北省,山东省，江苏省和广西省等主要产区菌株分离纯化。并获得柑橘疮痂病菌和筋葡黑豆病菌对照菌株。建立了病菌稀释单菌落分离及研磨快速扩繁体系,并对不同菌株的培养性状和致病性进行r初步研究，发现不I可菌侏间存在生长速度、形态和产毒的差异：完成已获得菌株的形态和分子鉴定工作。2 .花生疮痂病菌毒素提取条件的初步建立：掌握从花生疮加病菌中提取毒素的方法。菌饼干燥后于丙阳中连续两次萃取6h后合并，旋转蒸发后用丙酶溶解得到毒素提取液，用薄匕色谱法进行鉴定。3 .筛选出抗感品种，明瑜接种条件：已完成辽宁主要花生品种的抗病性鉴定工作，筛选出白沙1016为高感品种，为病原菌及毒素的生测提供r试哙材料，明确花生疮痴病菌及毒素的接种条件。4 .建立了白沙1016的细胞悬浮体系：课题组通过组织培养技术，以白沙1016为试材初步建立细胞悬浮体系“愈伤诱导：MS添加1.5mg1.2,4-D1.omg/1.KT+3.0mg1.&BA：悬浮培养:MS液体添加2.5mg1.2.4-D+1.5mg1.KT+2.5g1.6BA+30g1.熊糖。颈期成果预期研究成果以技术体系、研究报告和发表学术论文的形式进行汇报，具体如下：（I）建立一食适宜花生疮痂病菌致病机制研究的不同品种花生细胞悬浮体系；（2）明确花生疮痂病菌毒素在致病过程中对细胞膜的损伤和毒害作用；（3）探索毒索在花生疮痂病菌致病过程中的生理生化机制，分析活性氧在花生细胞程序性死亡和寄主-病菌互作过程中的作用及其机制：（4）明确活性氧淬灭剂对花生细胞渊亡的缓解或抑制作用及对病杏侵染扩展的防控机制。(4)发表研究论文2-3篇，其中SC1.论文1篇，培养研究生.2-3人申请者学历和分加科研工作简历周如军，男，汉族，1979年IO月生，博士，副教授，硕士生导师，现任沈阴农业大学植物保护学院植物病理教研室副主任，主要从事花生和药用植物其菌病击及病害流行教学和研究工作。兼任国家职业技能鉴定植保工和中药材种植员高级考评员。先后获沈阳农业大学优秀指导教师、青年骨干教师和十佳青年教学科研岗位能手等称号.2014年入选辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划。申请者发表或叁与的主要论着目次和获奖情况近年来的研窕工作主要围绕花生主要病害传播动态和流行机制及安全防控技术、药用植物病击病原鉴定及监测等研究方向展开。在上述领域主持2009-2010沈阳农业大学青年教师基金和启动基金2项，2013年主持辽宁省博士启动基金“花生疮痂病流行动态及其模拟模里的研究(20131106)”1项，2014年主持辽宁省农业领域育年科技创新人才培养资助计划“花生疮痂病侵染机制及其流行成灾关键因子研窕<2OI4O56)-I项，参加国家自然基金、农业部公益性行业科研专项、科技支撑计划、辽宁省自然基金和辽宁省农业攻关项目等7项。在P1.antDisease»Phytoparasitica-.MyCOIogiCaIProgreSS、植物病理学报、中国油料作物学报和£植物保护学报等国内外学术期刊发表论文30余篇，其中SeI收录IO篇。主编药用植物病害原色图鉴1部，副主编图说花牛.病虫害防治关篌技术3等著作4部，参编3部。先后获辽宁省政府科技进步三等奖2项，市厅级科技进步奖2项。1 .周如军.崔建潮,傅俊范*.除能.薛彩云.花牛.褐斑病)笥和网掰病菌混合侵染而侵柒概率和港育期的影响切.中国农业科学.2015.48(21),4264-4271.2 .何晶晶.周如军学,崔健潮,徐拈,傅俊范,吴楠,不同杀曲剂对花生网殂病菌室内毒力测定及田间防效研究叫.中国油料作物学报.201S,37(4h525-531.3 .周如军.徐枯，王大洲.杨风悒薛彩云.傅俊范.辽宁花生粉斑病发生及时间波行动态模型研究北中国油料作物学报,2014,36(4):533-537.4 .周如军.馀辅.傅俊范,崔建潮，何品品，薛彩云II宁花生品种对疮樨病抗性及流行时间动态分析叫.植物保护学报.2014.5(41):597-601.5 .周如军傅俊范，王大洲，杨凤艳,薛彩云.辽宁花生抢加病发生调查及流行因素分析力.他物保护,2013(1):159-161.6 .HaijiaoXu.KujunZhou.JunfanEu.YucYuan.Hongbo1.i,NingHao.CharacterizationofSderntinianiva1.iscausingSc1.erotiniaro<ofPu1.saii1.1.ak>rea>uinChina.EuropeanJnuma1.ofP1.antPatho1.ogy,2015.143(1):1-97 .Yuan.Yuc.RujunZh<>u.HaijiaoXu.JunfanFu.NingHao.Hongbo1.i.(Xrcurrcnccofgrcj1.eafSPOtofSedumery1.hms1.ictumcausedbyCercoswracf.PSeUdOkaktnChoesinChina.Journa1.ofPhytopatho1.ogy.2015.163(11-12):997-1001.8 .Yang-HuiOu.Ru-JunZhou,Jun-FanFu.YueYuan,I1.ui-JiuoXu.Paracerv(tsporadicumnico1.asp.nov.fromChina.Myco1.ogica1.Progress.2015.14(4):15.9 .Zhou,R,Xu.H.,Ou.Y.Hao,N.,F,J.Morpho1.ogica1.andmo1.ecu1.aridentificationofPowderymi1.dewofC1.ematixmatishuricacausedbyEtysipheaqui1.efiaeinChina.Phytoparasitica.2015,43（1）:15-19.10 .Zhou,R.J.,Yuan.Y.,Xu,H.J.,Fu.J.F.Ou.Y.H.FirstNPOnofanthracnoseofMahvsy1.vestmcausedbyCo1.1.etotnchumIrifoiiiinChina.P1.antDisease.2014.98（11）:1587.申请者已完成或正在承担（负责或参加）省级以上（含省级）各类科研计划、蓄金资助项目情况（包括：项目名称、编号、来源、起止年月、进展等）（限制字数；500字）辽宁省博士后动基金项目“花生疮麴病流行动态及其模拟模型的研究（20131106）”和辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助许划项目“花生疮挣病侵染机制及其流行成灾关博因子研究2014056）”项目。（IX项目提出背景（【提示】相关领域国内外发展现状与趋势；我省现有技术基础；立题必要性；项目申报单位实施该项目的优势.限制字数：500字）花生Srachisgpd是我国主要的经济作物和油料作物，种植面积位列世界第二位，总产量居世界第一。近年来，花生疮痂病（SPmaradidisBi1.aucour1.CtJCnkinS）危害越加严重，导致我国福建、山东和辽宁等主要花生.产区大面枳减产，一般病因减产IO%3O%,严重田块损失可达50%以上。花生疮痂病为近年来新流行病害，在寄主与病菌互作等方面尚未见研究报道，研究基础薄弱，木项目以花牛.疮痂病菌为研究对象，通过对花生.疮痴病菌毒素对寄主损伤和细胞凋亡的作用及其在寄主-病菌互作过程中的作用机制研究，明确花生疮痂病菌毒素（ESC）的毒力作用及其在病原菌-植物互作过程中的地位，为后期抗病育种和新型防控技术研究提供理论基础。科学水平及意义花生疮痂病为辽宁省花生产区新爆发式流行性病害，发生区域广，严正出块损失可达50%以上，已成为花生产业持续发展中亟待解决的植保问题。国内外对于花生疮痂病的研究基础较为薄弱，无法诠择病菌与寄主之间的互作机制，阻碍了该病害的深入研究及后期的抗病育种、新型安全防控技术的开发。本项目以花生疮痂病菌为研究对象，深入开展花生.疮痂病菌毒力因子筛选、毒素在致病中对寄主植物损伤和细胞凋亡作用及其作用机制等研究工作，探索花生疮痂病菌与寄主的互作机制。研究过程中会建立花生细胞悬浮体系，并对各种因素进行优化，该技术为花生的遗传转化和功能基因转化提供材料和技术支持。另外，木研究中将会探讨淬灭剂等对花生.疮痴病菌毒素的缓解和抑制作用,进而诚轻病害的发生和流行程度,该部分研究结果对于寻找新型、安全的病害防治方法提供了理论支持，对于花生减量使用农药具有重要意义。结合申请人前期对辽宁花牛.疮痂病侵染过程和流行因素的研尢基础，本项目的研究结果可.以很好地解释近年来辽宁花生产区花生疮加病爆发式流行因素和流行机制，不仅能够完善花生疮痂病的致病机制的理论探讨，何时对我省花生产业的健康发展和农民增收具有重要意义。（3）、项目主要内容与指标（【提示】主要研发内容；拟解决技术关健点及主要指标.限制字*i500字）（I）明踊花生疮痂病菌年素在致病过程中对细胞膜的损伤和得害作用：（2）分析活性氧在花生细胞程序性死亡和寄主-病菌互作过程中的作用及其机制：（3）探索毒素在花生拉痂病菌致病过程中的生理生化机制“（4）明确活性氧淬灭剂对花生细胞渊亡的缓解或抑制作用及对病害侵染扩展的防控机制。（5）发表研究论文2-3篇，其中SC1.论文1篇，培养研究生2-3人。（4）、项目主要创新点（【提示】主要创新点，以及期获得的研究成果筒况.限制字数：500字）（1）在花生疮痂病研究过程中，首次揭示花生疮痂病菌毒素为花生疮痂病的毒力因子，为花生疮痂病的致病机制的研究提供理论基础.（2）利用细胞悬浮培养技术在细胞膜和活性氧两个方面研究花生疮痂病菌毒素对寄主植物细胞的损伤及其诱导细胞程序性死亡过程，能够更加准确地阐述其作用机制。（3）通过添加活性氧淬灭剂探究其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒害作用，不仅能够反向证明而素是花生疮加病菌的重要致病因子,而且研究结果能够为花生疮痂病的综合防治提供一个崭新的视角。（5）、项目实籁的可行性（【提示】项目拟采取的研究方法（或技术路线、实凝方案）的可行性简况.限制字数：500字）（1）花生疮痴病菌毒素对寄主损伤和细胞调亡的作用花生疮痫病菌毒素对病JS形成和扩展的影响：采用前期的接种方法，在不同的环境条件卜.，通过网格法测量叶面积，以浸染位点数计算侵染概率。花生疮疯病三毒素对细胞凋亡的作用：在悬浮体系中添加毒素,通过荧光染色法检测细胞存活率，并进行DNA条带分析。（2）花生疮痂病菌毒素对寄主细胞凋亡作用机制研究花生疮Ifi病菌毒素对寄主防御B1.的影响动态，通过测定植物防御施活性，确定在毒素浸染叶片的过程中寄主植物的生理变化及花生疮痂病菌毒素的作用机制。花生疮痫病If毒素对寄主细胞质膜过氧化和脂质过氧化的影响：丙.:醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定，膜破裂程度以电解质渗透率为指标，探究毒素对细胞损伤的机制花生疮病病三毒索对活性氧产生动态及细胞凋亡的作用机制：采用DaubandHangartcr的方法进行测定：02用四瞠氮蓝方法测定：H?O2采用Uchida等的方法。（3）淬灭剂对花生损伤和细胞凋亡的抑制作用在毒索接种植株和细胞的不同时间添加胡萝卜素、半胱交酸等不同活性氧淬灭剂，通过病斑大小和TTC染色法测定细胞活性，明确Qz等活性氧在浸染中的机制。（6）、项目覆期目标与效果前景分析（【提示】项目期目标与效果（包括经济、社会、环境等）分析商况.限制字Ib500字）（1）项目研究过程中花生细胞悬浮体系的建立和优化不仅仅对本项目的研究提供了便捷试验材料和条件，同时对于其他花生病害致病机制研究工作以及如花生品种资源保存、遗传转化和功能基因插入突变等等相关研究工作提供了技术平台。（2）本项目采用细胞悬浮体系，从细胞膜损伤和领化胁迫两个角度对花生疮伽病菌毒素在致病过程中的生理生化作用机制进行了深入研究，该研究结果对于花生疮痴病菌致病性后续研究深入研究工作提供了理论研究基础（3）本项目中通过添加活性氧部灭剂探究其在缓解或抑制毒素对细胞的损伤和毒害作用，不仅能够反向证明毒素是花生疮痂病的的比要致病因子，而且研究结果能够为花生疮痂病的综合防治和新型安全药剂的创制提供一个崭新的视角。（IX项目也主要成员研究能力与分工构成情况，以及正在承担（负贵或叁加）的省级以上（含省级）各类计划、基金资助项目情况（限制字数：500字）（2X承担单位现有研究仪叁、设备情况，以及借助省级以上（含省SD重点实验室开展本项目研究的情况I限制字数：500字）课题组所属植物病理重点实验室依托辽宁省重点学科沈阳农业大学植物病理学科，设备条件先进。近年来沈阳农业大学快速发展，植物保护学科在此施础上建立了学科中心实收平台，拥有PCR基因扩增仪（英国，Hybaid1.imited）,CFX96实时荧光定量PCR（美国Biorad公司），Heraeus型育性能台式冷冻离心机（德国），GZP-25O型光照恒温培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器厂），PrOICani121EFf白质双向电泳系统（美国Bio-rad公司），DCodcSystemforIXiGE梯度凝胶电泳系统（美国BiO-rad公司）,ChemiDOC-XRS化学发光凝胶成像系统（美国Bio-rad公司），Mi1.1.i-Qiniegra1.IO超纯水一体化智能系统（美国Mi1.1.ipore公司），台式高速冷冻离心机（EPPCndOrf5804R）,超低温冰箱（SANYoMDF-U32V）,恒温光照培养箱（SANYOSGC660）及各式离心机、光谱仪和酹标仪等常规分子试验和生理生化试验仪器设备，能绣满足本课题研究过程中所用仪器和设备的需要。（3）、前期相关工作进展、以及研究时间及其他相关保证条件I限制字数：5。0字）1 .已完成供试菌株和对照菌株分离纯化及病原学研究工作：截止2016年底，课题组已完成对辽宁省，河北省,山东省等主要产区菌株分离纯化。并获得柑橘疮痂病菌和葡萄擞豆病菌对照菌侏“建立了病菌稀释单菌落分离及研磨快速扩繁体系，并对不同菌株的培养性状和致病性进行了初步研究，发现不同菌株间存在生长速度、形态和产戏的差异：完成已获得菌株的形态和分子鉴定工作。2 .花生疮痂病菌毒素提取条件的初步建立（2016年3月-9月）：掌握从花生疮痂病菌中提取毒素的方法。3 .筛选出抗感品种，明确接种条件（2015年3月-2015年10月）：已完成辽宁主要花生品种的抗病性鉴定工作，筛选出白沙1016为高感品种，为病原菌及毒素的生测提供了成验材料。4 .建立了白沙1016的细胞悬浮体系2016年7月-2016年12月）：课题组通过组织培养技术，以白沙1016为试材初步建立细胞悬浮体系“项目覆期进度安排（【提示】注明覆期实施进度安排的初步计划（即阶段性工作要点）,限制字段：1000字）2017年3月2017年8月8优化花生细胞悬浮体系：利用花生疮痂病菌毒索对花生进行接种,明确其在侵染过程中对病斑扩展的影响：测定明确花生痴囊腔菌毒索在植物发病过程中生理生化等动态变化，进而为花生揄囊腔菌毒素致病机制的更深一步研究做好研究基础。201牌1月.2018年12月：提取花生.疮摭病菌毒素，并加入到花生细胞悬浮体系中，通过对细胞损伤的测定、细胞内丙二醛的产生以及其产生活性氟对细胞的毒害作用的研究，明确花生痂囊腔菌毒素对细胞损伤及其使细胞膜过氧化的机制，探索其诱导细胞程序性死亡的的机制。参加国内外学术会议1次。发表学术论文12篇。2019年1月.2019年12月：花生疮痂病菌毒素对活性氧产生动态研究：活性氧在细胞凋亡过程中的作用机制；通过添加能使我失活的淬灭剂等试剂，明确淬灭剂对细胞损伤以及花生疮痂病的抑制作用，整理研究结果，撰写结题报告，撰写研究论文12篇。