全胃切除术后家兔营养不良的实验研究_0.docx

全胃切除术后家兔养分不良的试验探讨临床医学论文-全胃切除术后家免养分不良的试验探讨作者：任重牛伟新刘寒何国栋王洪山高晓东【摘要】目的通过建立家兔全胃切除和迷走神经干切断的模型，初步探讨全胃切除术后所引起的进食削减、体质虽下降、养分不良的缘由。方法新西兰兔24只，随机分为A组(比照组)、B组(全胃切除组)和C组(迷走神经干切断组)，视察B、C组手术后体质量:比、进食;Q：、血浆胆囊收缩素、胃动素含鼠、近段小肠上皮单糖传运体G1.UT5和SG1.T1.的InRNA表达状况等指标，并和A组比较。结果与A组相比，B组术后体质量比、进食殳明显卜.降。家兔术后血浆胃动素含危变更不大，胆囊收缩素含量分别于术后第3天和第14天上升(PO.05)°B组家兔十:指肠和空肠G1.UT5DiRNA表达显著下降(P0.05和0.01)o在十二指肠和空肠B组家兔SG1.T1.mKNA表达均无变更(PO.05)OC组家兔术后上述指标与比照组比较，差异均无统计学意义(PO.05)O结论全胃切除术后与胃动素相关的消化间期小肠蠕动和食物排空速度可能未出现变更，而胆囊收缩素含眼上升可能与中枢性摄食抑制、食欲下降有关；胃切除后家兔小肠近段G1.UT5mRNA表达明显下降，SG1.T1.mRN表达无变更。迷走神经干的切断在这些病理生理变更中不起重要作用。【关键词】全胃切除术：迷走神经干切断术；养分不良；家兔【Abstract】ObjectiveToexp1.orepre1.iminariIythecausesforanorexia,weightreductionandma1.nutritionaftertota1.gastrectomybyestab1.ishingrabbitmode1.oftota1.gastrectomyandvagotomy.MethodsTwentyfourNewZea1.andrabbitsweredividedrandom1.yintogroupA(contro1.group),groupB(undergonetota1.gastrectomy)andgroupC(undergonevagotomy).Theratiooftheweight,theamountoffoodtaken,thecontentofcho1.ecystokinin(CCK)andmot1ininp1.asma,theexpressionofthemRNAofG1.UT5andSG1.T1.attheepithe1.iumoftheproxima1.partofsma1.1.intestineingroupsBandCafteroperationwereobservedandcomparedwiththoseingroup.Resu1.tsComparedwithgroup,theratiooftheweightandtheamountoffoodtakeningroupBwerereducedmoredistinct1.y.Thecontentofmot1iningroupBshowed1.itt1.echange,whiIethecontentofCCKwase1.evatedatdays3and14afteroperations(PO.05).TheexpressionofG1.UT5mRNAatduodenumandjejunumdecreasednotab1.yingroupBcomparedwithgroupA(PO.05andPO.01respective1.y).ButtheexpressionofG1.UT5mRNAatduodenumandjejunumshowednostatistica1.deferenceingroupBcomparedwithgroup(PO.05).IngroupC,a1.1theseindiceshadnostatistica1.deferencecomparedwithgroup(PO.05).Conc1.usions.Aftertota1.gastrectomy,theperista1.sisofsma1.1intestineandtheevacuationofthefoodinInterdigestiveperiodcorre1.atedwithmot1inmaynotchange,whi1.etheincreaseofthecontentofCCKmaycausecentra1.feedinginhibitionandanorexia.Aftertota1.gastrectomy,theexpressionofG1.UT5mRNAattheproxima1.partofsma1.1.intestineoftherabbitsisdecreasedbutthatofSG1.T1.mRNAremainsunchanged.Vagotomyshowsnocontributiontoa1.1thesepathophysio1.ogicchanges.KeywordsTota1.gastrectomy;Vagotomy;Ma1.nutrition;Rabbits全胃切除术是治疗胃癌的重要术式之一。但由于其手术范围广，创伤较大，术后不可避开地会发生一些病理生理上的变更。全胃切除同时也伴随着迷走神经干的切断，手术以后所出现的种种病理生理方面的变更是由于机体失去胃引起的还是迷走神经干切断引起的，也没有明确答案。本试验通过家兔全胃切除和迷走神经十切断模型的建立，视察术后体质品、血浆胆囊收缩素、胃动素含黄、近段小肠上皮单糖转运体:Na+依靠性单糖转运体1（sodiumdependentg1.ucosetransporter1,SG1.T1.）和易化性单犍转运体5（faci1.itatedg1.ucosetransporters,G1.UT5）的mRNA表达状况等指标的变更，初步探讨全胃切除术后养分状况低下的缘由。1材料与方法1.1材料1.1.1动物：成年新西兰兔24只，雌雄不限，体质埴2.2-3.2kg,由复旦高校附属中山医院动物试验室代购。1.1.2 仪器:立式压力蒸汽灭菌器（1.SB501.型）购自上海华线医用核子仪器有限公司：低温高速离心机（1.abofUge100R型）购自德国HeraeusInstruments公司；电热恒温水浴锅（H.H.S型）购自上海医疗器械五厂：RNDNCa1.cu1.ator仪（GeneQuantII型）购F1.PharmaciaBiotech公司；PCR仪（PTC150型）购自美国MJResearch.INC.公司：电泳仪购自（DYA型）上海生化所巴斯生物技术开发公司；测趾用电泳条带灰度软件（AIPhaImagerTM2000DocumentationAna1.ysisSystem,A1.phamager3.21软件）购F1.A1.phaInnotechCorporation公司。1.1.3 试剂：SK1361试剂盒、DEPC液、01igo（dT）15、10mmo1./1.4dNTP混合液、RevertAidTMMMu1.V反转录酶、正义及反义引物、TaqPCR催化酶、GcneRu1.erTM50bpDNA1.adder、琼脂糖凝胶，均购自生工生物工程（上海）有限公司。演化乙锭由梵旦高校附属中山医院中心试验室惠赠。1.2动物模型的建立家兔分为3组，每组8只。A组为假手术组（比照组），B组为全胃切除组，C组为迷走神经十切断组。氯胺朋1mg/kg肌肉注射麻醉。组家兔打开腹腔后用生理盐水纱布覆盖内脏，1h后关闭腹腔。B组家兔行全胃切除（切除范围从贲门至幽门近侧约0.5cm处），然后将食管拉下与近段十二指肠行端侧吻合。C组家兔进腹后钝性分别食管下段四周结缔组织，包括筋膜，神经，血管，予切断，结扎。使食管下段贲门四周完全游离，食管肌层光滑，不见任何结缔组织、神经组织。手术后均肌肉注射庆大霉素针4万U。3组家兔术前均禁食12h（不禁水），B组家兔术后第1、2天静脉输液。A、C组术后不必输液。3组家兔均于术后第2天饮5%葡萄牺生理盐水，第35天喂食青菜叶，第6天过渡到正常兔饲料饮食。1.3 体质成的测定及体质Q比的定义3组家兔分别于手术日（术前）、术后第5、10、15、20、25、30天上午8点喂食前测量体质量。B组家兔手术后即刻测心切下的胃质用，术后测得体质让加上胃质量即为当日体质量数据1因3组家兔术前可能存在着体质吊:上的不均衡（为提高手术存活率，B组家兔一般采纳较健壮，体质量偏重的家兔），故采纳体质品比作为计算指标，即每只家兔体质品以手术日（术前）为基准，计算当日体质量测量数值与手术日（术前）体质量测量数值的比值,定义为体质显比。1.4 进食量的测定3组家兔分别于术后第10、15、20、25、30天测定24h的进食敬（计算当天上午8时至第2天上午8时的进食量）。1.5 血浆胃动素、胆囊收缩素含晶的测定3组家兔分别于术后第1、3、7、14天上午8点从耳缘:动脉采血3.54m1.«采血前禁食（不禁水）12ho然后制成血浆。用放免法测定血浆胃动素和胆囊收缩素的含M:（由其次军医高校神经生物学教研室代测）。1.6 近段小肠上皮G1.UT5和SG1.T1.mRN的检测1.6.1黏膜标本的采集：3组家兔小肠黏膜标本均在术后第30天采集。采集时间为16：00-17：00。采集前禁食24h（不禁水）。家兔麻醉后切开腹腔，分别距离幽门10cm和100cm向远侧取下约10cm的肠段，作为十二指肠段和空肠段。将取下的肠段沿对系膜缘纵向剪开，放入无菌冰生理盐水震荡漂洗3次，最大限度的清洗掉黏附在黏膜上皮的小肠内容物，包括食物残渣、黏液、杂质。用经过消毒、1：1000DEPC液脱酶后的玻璃片将黏膜组织刮下。RTPCR方法检测小肠黏膜SG1.T1.和G1.1.T5mRNA的表达。PCR过程中全部离心管、移液管都要经过灭菌。1.6.2PCR扩增步骤：94C变性5min,然后进行30个循环，每个循环包括94C变性30s,60C退火30s,72C延长1Inino扩增结束后PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶（加入溟化乙锭51/100慨1）中电泳。所获条带用灰度测易软件进行灰度分析，测定目的基因产物灰度和内参照（actin）基因产物灰度的比率（PCR率），半定吊:测定目的基因的表达。见表Io1.7 统计学分析3组数据均数差别检验采纳t检验。PO.05表示差异有统计学意义。2结果2.1术后3组家兔体质量变更、进食量变更、血浆胃动素和胆囊收缩素的值(表25)表1用物序列及其在基因组中的位置核酸序列位置产物大小SG1.T1：Sence5TCATGATGGTGGGCTCTGTG3652671Antisence5GCCGCGCGGCACTTTG31065-1046414bpG1.UT5:Sence5,TGACGGAGTTCTACAACGAC3161-180ntisence5CAGTCTAGGGCCCGT3474-455313bpactin：Sence5CCTGTACGCCTCTGGCCGTACCACT32088-2112ntisence5CTGTGCCGCGCTCGGTGGGTCT322612237174bp表23组家兔体质黄比变更表33组家兔术后进食吊:对比表43组家兔血浆胃动素含让对比(单位：pgm1.)表53组家兔血浆胆囊收缩素含后对比2.2十二指肠、空肠上皮G1.UT5和SG1.T1.mRN的表达十二指肠上皮G1.UT5mRNA的表达,B组比A组显著减弱(PO.05)：SG1.T1.mRNA的表达与A组比较差异无统计学意义(P005)。见图1、2和表6。空肠上皮G1.UT5mRNA的表达,B组比A组显著减弱(PO.01)：SG1.T1.mRNA与A组比较差异无统计学意义差0.05).见图3、4和表6。十二指肠上皮G1.UT5mRNA.SG1.T1.mRNA的表达与空肠上皮比较差异无统计学意义(P005)o见图5、6和表6»表63组家兔十二指肠、空肠上皮G1.UT5InRYA和SG1.T1.mRNA的PCR值表达3探讨全胃切除术对机体的功能第原和生活质址均产生较大影响。其中最明显的就是食欲下降、体质品减轻、养分不良，缺少饥饿感，90$的患者诉有早期饱胀感1,60%70%的患者术后体质最过轻，平均比术前减轻25%2O其详细机制目前尚未阐明。3.1 动物模型建立以及3组家兔体质后比的变更全胃切除模型的建立曾采纳过多种动物，包括狗、猪、大鼠、猴等。由于狗、猪、猴试验成本较高，大鼠体积较小、无法反复采血进行相关检测，而家兔体积适中、性情和顺、依从性相对较强、试验成本较低，故本试验采纳家兔制作全胃切除模型。在制模过程中留意以下问题。理论上家兔的胆总管开口于十二指肠起始处。但我们却发觉有部分家兔的肝十二指肠韧带干脆与胃窦部相连，假如行彻底的全胃切除将不可避开地导致胆总管误结扎和损伤，术后动物出现重度阻塞性黄疸而于短期内死亡。所以我们在切除胃时远端切线设置在幽门近侧约0.5cm处，以爱护肝十二指肠韧带，避开胆总管受到损伤，然后用碘伏纱布擦拭残余胃窦部黏膜，破坏黏膜细胞，尽址消退残余胃窦黏膜对术后视察指标的影响。做吻合时避开将远端食管与残胃吻合，这样可导致术后较高的吻合口漏发生率。我们先将残余胄窦部用丝线关闭(用3O丝线缝合一层即可)，然后在十二指肠起始处对系膜缘剪开一长约03Cm的小口，将食管拉下与小口行端侧吻合，用30丝线行单层缝合即可，事实证明可基本杜绝吻合口漏的发生，同时也可将残余胃窦新膜旷置,进一步削减其对视察指标的影响。本试验显示行全胃切除后家兔进食品与比照组相比明显削减(PO.OD,体质量下降,进行性消瘦。术后第10天B组家兔体质后比起先低于A组家兔(P005).此后，B组家兔体质量比呈进行性下降，至术后第15天后，B组家兔体质品比远远低于A组家兔(P0.01)。而C组家兔术后第10天进食雄有所削减(P0.05),但在第15天后,进食品:渐渐复原，与比照组相当(P005),在整个试验过程中体质量比与A组比较均无差异(P0.05)。说明迷走神经干的切断在全胃切除术后所出现的进食削减、体质枇下降、养分不良等病理生理变更中不起主要作用。3.2 手术后胃肠激素的变更胃肠激素在机体进食、养分物质的汲取中起重要作用，最受关注的是胃动素和胆囊收缩素(CCK).CCK被认为是一种饱感因子"，必机体内重要的饱中枢信号"3。本试验显示，行全胃切除及迷走神经干切断后血浆胃动素含求与组家兔相比未发生明显变更，说明全胃切除后胃动素所引发的消化间期小肠蠕动和食物排空速度未发生变更，全胃切除后食糜通过小肠的速度可能因此未发生变更，其与家兔术后的养分状况恶化关系并不大。兔类胃的容积占消化道总体容积的1/3左右。术后第1天家兔还处于禁食阶段，无食物摄入，故血浆中CCK含品变更不大。进食后由于失去了胃的缓冲作用，摄入的食物干脆进入十二指肠，引起肠道碳水化合物浓度突然上升，机械性牵张作用急剧加大，促使I细胞大比分泌，可能是引起术后第3天CCK分泌增加的缘由。当B组家兔由菜叶过渡到正常饲料饮食时还无法适应，进食很少，可能是术后第7天血浆CCK含品有所下降的缘由。另一绿由也可能和样本成不足有关。到r术后第14天B组家兔渐渐适应r正常兔饲料饮食，进食有所复原，体内CCK含后再次出现上升。这也说明全胃切除后家兔体内CCK含眠总体趋势是增高的。C组家兔手术创伤较小，消化道结构未发生明显变更，影响CCK分泌变更的因素相对较小，可能是术后血浆CCK含设无明显变更的缘由。本试验说明全胃切除后家兔血浆中CCK含晶总体趋势是上升的。全胃切除术后血浆胆囊收缩素的上升在随后所出现的食欲低下、养分不良等现象中可能起r重要作用。但手术后视察时间较短（仅3d至2周），有待于进一步探讨。3.3 手术后近段小肠上皮单辆转运体的变更碳水化合物主要在小肠汲取，大多数在小肠上皮被分解为单糖，经相应的单粉转运体被汲取人体内。小肠上皮细胞主要有两种汲取单聃的转运体：SG1.T1.和G1.UT5。SG1.T1.特异性转运D葡萄处和D半乳酒，与钠离子协同转运，转运过程是耗能的。小肠上皮黏膜对单糖的汲取与SG1.T1.表达明显相关4OG1.UT5特异性转运D果粉，通过易化作用将底物顺浓变差转运入上皮细胞，其转运过程不耗能。位于小肠上皮细胞基底膜的G1.UT2转运体随后将汲取入小肠上皮细胞的D葡萄糖、D半乳糖、D果糖转运出小肠上皮细胞，进入血液循环。B组家兔术后1个月小肠近段上皮细胞G1.UT5mRNA表达明显削减，可能导致肠道碳水化合物汲取的下降。SGI.T1mRNA表达未出现明显变更。但我们并不能由此认为由SG1.T1.所介导的单糖汲取功能正常。本试验只是对SG1.T1.mRNA的表达灰度进行半定病的测定,没有对SG1.T1.蛋白及蛋白翻译以后的修饰调控进行相关检测，还有待于进一步探讨。Tavakko1.izadeh等5通过对小鼠的探讨，发觉SG1.T1.和G1.UT5基因表达的通路与迷走神经无关。本试验中C组家兔在行迷走神经切断术后与比照组相比小肠G1.UT5与SGIJ1.mRNA的表达无明显差异，说明在全胃切除术后G1.UT5mRNA表达的下降与迷走神经的切断无关，可能另有缘由。全胃切除术后机体养分不良的机理特别困难。本试验认为全胃切除术后胆囊收缩素的上升可能导致动物中枢性厌食。而手术以后养分状况恶化好像与消化间期小肠端动以及食糜通过小肠的速度无关，和迷走神经干的切断也无关。手术以后小肠上皮G1.UT5mRNA表达的下降也与迷走神经的切断无关，可能另有缘由，有待于进一步探讨。【参考文献】1Brad1.eyE1.3rd,IsaacsJT,HershT,eta1.Nutritiona1.consequencesoftota1.gastrectomy.AnnSurg,1975,182(4):415-429.2Zitte1.TT,G1.atz1.eJ,Mu1.1.erM,eta1.Tota1.gastrectomysevere1.ya1.tersthecentra1.regu1.ationoffoodintakeinrats.nnSurg,2002,236(2):166-176.3舒鼎铭，覃健萍，曹长,等.胆囊收缩素(CCK)的生物学功能探讨进展.饲料工业,2004,25(11)：12-16.41.ooDD,ZeuthenT,ChandyG,eta1.CotransporterofwaterbytheNa+g1.ucosecotransporter.ProcNat1.cadSciUSA,1996,93(23):13367-13370.5Tavakko1.izadehA,RamsanahieA,1.evitsky1.1.,eta1.Differentia1.ro1.eofthevagusindiurna1.geneexpressionrhythmsinthesma1.1.intestine.JSurgRes,2005,129(1):73-78.