免疫共沉淀原理及实验方法.docx

注册i登录：发表文章免疫共沉淀原理及试验方法2007-03-2216:07:46免疫共沉淀# 原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的-proreinA"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法.目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的PrOreinA就能吸附抗原法到精制的目的.试验最须要留意点就是抗体的性质.抗体不同和抗原结合实力也不同，免染能结合未必能用在IP反应.建议细致检查抗体的说明书。特殊是多抗的特异性是问题.其次，要留意溶解抗原的缓冲液的性质.多数的抗原是细胞构成的蛋白，特殊是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必需运用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合.另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白.即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原确定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP胜利，也是许多蛋白与抗体共沉的凄惨结果.再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的屐冲液必需加蛋白每抑制剂，低温下进行试验.每次试登之前，首先考虑抗体/级冲液的比例.抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清.线冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀秆.欲速则不达.确定好比例很必要.（待馔）二打算：器械懒量高速冷冻离心机够液枪# 旋转盘# 电泳设备# VorteXK药器端氨及组限粉碎器Seppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS电泳试剂#抗体(单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig免血清)#PBS#NaN3#proteinAsapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1 .RIPA星冲液(最终浓度)1.MTris-HC1.(PH7.4)5d1(IOidC5MNac1.15m1.(150ndi)0.5MEDTA(PH7.4)51.(5M)20%TritonX-10025三1(1«)10%DOC50n1.(1»)10%SDS5m1.(o.1»)T1.CK18.5mg(0.1国TPCK35ag(0.MDDW395a1.toa1.500m1.另外，运用之前加1.*jMSF(PMSF溶在酒精，浓度100BM,-20度遮光保存.留意不易溶于水)2 .NP40Iysis级冲液IMTris-HC1.(PH7.4)5m1.(IOnM)5MNac1.15m1.(150nM)0.5MEDTA(PH7.4)51.(5oM)20NP40251.(1%)T1.CK18.5mg(0.In1.DTPCK35ag(0.2M)DDW450b1toa1.500n1.运用前加ImM的PMSF留意点I*Tri8级冲剂PH随温度改变，高浓度盐酸清定时发热，冷却后PH增高.* 反复运用PMSF要留意保管方法.* 1和2的缓冲剂的区分在于界面活性剂.TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温柔，DoC<SDS是离子性的强活性剂.留意遗忘加TritonXT00,只加DOC,SDS,可能使抗体完全失去活性.1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温柔，却可能造成抗原溶解不全.* 两方都有EDTA,对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的.依据自己须要调整.EDTA用NaoH清定.Protoco1.1 调制proteinAS叩haroseproteinAsepharose5b1溶于20三1.含0.02%NaN3的PBS离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02WaN3的PBS,离心后去上清，重复2次，最终沉淀加20三1.含0.0MN3的PBS,冷寂保存用单抗做一抗时，把PrOteinASaPharOSe先用抗It1.g免血清处理（每50u1.protinASapharose用1-5UI血清）.旋转1.-2h,混匀后，再离心1.-2s去上清后，加PBS,VOrteX混合，离心去上清，重复二次加含0.02NaN3的PBS到原来体积，冷存.避开长期保存2 .抗原的检出以下掾作全在冰面或4度进行去除细胞培育液，用冷PBS洗一次.加R1.PA,溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀.RIPA的量，6cb的培育皿加11（蛋白质的量为500og1.）,组织块用液氨将碎，在级冲剂中捣匀，蛋白定量.30m,1500OrPa离心，上清转移到新tube不用移液枪，干麓从tube倒进另一个tube往上清加抗体，1!加2-5U1.抗体，冷室内旋转混匀Ih加PrOteinAsfharose50u1.*再混匀Ih5000rp三离心Isr使s>harose沉淀，去上清往Sapharose加RIPA,vortex混匀，离心，去上清.重复4次洗净.加电泳用sa三p1.e畿冲液40u1.,2三1煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像.3 .留意点At不蜩热运用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使试验失败.对无论怎么也除不去的混入蛋白，只运用上清的上半部，或用超速离心机.B：对电泳的非特异条带，最终可依次用含300»%IO1.NaC1.的R1.PA洗净各一次.（完）j:；III'Ji'876'包1.Uj1.z'',<ii-n<免疫共沉淀原理及试验方法SPANcIass=javaid=text9766免疫共沉淀（BRIS理，BRIP是利川杭雄很白城和抗体的特扑性玷作以及捌曲蛋白帧的“proreinA"特异性地给合到兔技球蛋门的FC片段的现象活用开发出来的方法,目前多用箱制的proreinA预先结合固化在aruar。呢的beads上.使之与含有抗陵的溶液及抗体反应后,beads上的prureinA就使啜阳抗原这到相刖的Ii的.IBRMBK成验城笫要耐强点就是抗体的性质.抗体不同和抗快站台实力也不同,免染假结合未必能用在W反应S建仪锦1校投伐抗体的说明悦特殊是多抗的将异性是打理，BRIBR1.Kft.要留意淅那抗原的废冲液的性战.石数的抗原是细取构成的送白,特殊是骨架Sfi白.缴冲液必须要使我溶解.为此,必需运用台有强界面活性翘曲堀冲浪,区管它有可能影响a分抗倏抗体的结合.M-Wf.如用弱界面活性渊到WsI胞.就不能充分溶解细胞第白.呻使溶解也产生与耳它的蛋C结介的结果.抗期.确定块被封闭，影响与抗体的结合,即使IP胜利,也是许多蛋白与抗体共沉的洪修结果.BRBR再次,为防止蛋白的分野，修饰.我解忧18的理冲浓必需加蛋日外抑制剂,低I1.下进行试ift.BRBR"次试於之前,首先考虎抗体，燥冲液的比例.抗体过少就不能检出抗麽,过多则就不能沉降在beads上.我存在上清.覆冲剂太少则不僮溶解抗魄.过多则抗Ki被裕择.欲速划不达.确定好比例很必要,恃绘)二打算：UW器微量/速冷冻离心机1.BR*移液怆BR时好5盘CBIdH电泳设在fBR1.svortex斐落潺时|#液缸及机蛔扮碎!ft【网加PPentUbe小R1.试剂IBR1.m细取IO1.织:即=Jfi白定取kitBRffSDS电泳试剂BR«枇体(单帆时地桂proteinG.二抗选择抗双IA请)1.BRs1.¾SBRuNa>3BRRpoteitSHPha山TBR试剂配刎:BR)抗炮缆白溶解缓冲液:BR1.R1.PA缓冲液(IA深浓度)1.WJINrriS-HQ.(WHd)5n1.<IOM)BXj5MNacI151.(ISOriI)BRO.SMEDTA(PH7.4)5n1.(5M)BR207ritonX-10025m1.(n)BR1.1.OPOC50111.(1%)BR10%SDS511>(o.1)BR71.CK18.511(O.1.nM)BRTPCK35m(0.2M)BRDDV395n1.BRtoa1.500m1.BRHJf-.运用之前加1.*3MSF(PMSF潜在酒精,浓度100eM,-20度助光保存.留念不妫济F水)BR2.MMOIysis缓冲液BRINTriB-He1.(PH7.4)Sn1.(IOnM)BR9W(nc1.ISm1.(1.50rii)KRO.SMEDTA(I'H7.4)Sn1.(SMI)HR2O%U,<tO2Sn1.(1%)KRT1.CK18.5n«(0.1.nM)11WTPCK35ng(0.20M)BRDDW45O111BRtoa1.5«It1.HBRI送M前加InM的P16FBR图惫点BR*TriS缠冲剂PH院湖度改变.i浓度抗酸酒定时发热.小却EPH埔岛.BR*反M运用PMSF要：和。保管方法.BRJ*1和2的缓冲剂的区分在J界面活性视Triu1.nX700.NP40是非卷子界面活性剂.作用温柔.DOC&1.t：SDS是国子性的鞋活性剂.留意遗忘加TritonX700,只加DoGSI1.S,可能使抗体完全失去活性。】的皈白变性效果强，可能报只抗Si/抗体结合,2的作用阻柔,却可能造成抗原溶解不全.BR两方都有EDTA.对抗炊而宫.二价离了Us,Ca等是心要的.依据自己须要调整.EDTA用NaOH满足.BRPr<tux:0BRBR1调制proteinsaharoseBRBRproteinAsaha>aeSn1.潘于SOn1.含00!S的PB离心2000转2分,去上清,在沉淀和0.02、M1.N3的PHS,离心后去上桶,SS2次,奴终沉淀加2Qn1.含0.D2WN3的PBS,冷就保存BRHBR用中抗做一抗时，把PrOteinASapharose先用tS1.Ik兔也所处理(毋50u1.proteinASapbaroscJIJ1-5U1.Ih溃).我转I-2h,混匀后.再离心1.-2sBRBR去上清后,PBS.VOrteX混合.痛心去上清.小复二次(BRBR：!加含0.023N3的PBS到原来体积,冷存.IB开长期保存.1HRBR2.抗IiI的检出Uud以下操作全保存面上4度进行IBRMBRJ去除细附培6液,M净PBS洗一次，加RIPA,涪解后.料移到eppentube中用VorteX混匀RIPA的瞅；6c11的培育皿加Im1.Gii臼疾的现为5«hw，n1.),蛆织块川液飘的碎,在姣冲剂中脂匀.蛋白定减.BRBR30%ISKIOr阿苏心上清转移到新IUk.不用移液枪.干府从IUk倒进处一个IUbefBRBR往上消加抗体.11加2-5U)抗体，冷空内旋转混匀】h(BR加proteinASnpiinroscSOuh再1句IhIBRBR500Drp自心】s,使SaPhRrose沉淀，去上清，ItsapharosefinRIPA,vortex泡匀.肉心,去上济，加复4次洸冷.BRBR加电泳用SUP1.e缓冲装40u1.,2n然潇.泳动后.国定/干惮皎.5t.BRBR3.S1.0tBR.不娴熟运用移液枪.合漏入沉淀的不溶性蛋白,使试验失败.对无论怎么也除不去的混入战白.只运用上消的上T部，或用超速阔心机.：HRH：对电泳的拿恰立条带，依终可依次用含300nM,IDS的RiPA洗冷各一次,(½)/SPANBR1.查看文章1 .免疫共沉淀技术路途(COIP)2007-05-0709:14打算工作：预冷PBS,RIPABuffer,细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最终一次吸干PBS：2 .加入预冷的RIPABUffCr（Im"107个细胞、K）Cm培育皿或150cm2培育版.0.5m1/5X106个细胞、6cm培育皿、75cm2培育瓶）3 .用预冷的细胞刮子将细胞从培育皿或培白瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，44C,缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4 .4"C,MOOOg离心15min,马上将上清转移到个新的离心管中5 .打算ProteinAagarose,用PBS洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度，建议减抻枪尖部分，避开在涉及琼脂犍珠的操作中破坏琼脂犍珠6 .每Im1.总蛋白中加入1001ProteinA琼脂糖珠（50%）.4C摇摆IOmin（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7 .4C,140OOg离心I5min,将上清转移到一个新的离心管中,去除ProteinA珠子8 .（BradfOrd法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀糅1：10倍以上，以削减细胞裂解液中去垢剂的影响（定量.分装后，可以在-20C保存一个月）9 .用PBS将总蛋白稀释到约11.,以降低裂解液中去垢剂的浓度,假如爱好蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应当稍高（如10gu1.）10 .加入肯定体积的兔抗到500UI总蛋白中,抗体的稀释比例因爱好蛋白在不同细胞系中的多少而异U.4C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯税活性分析建议用2h室温孵育12 .加入100U1.ProteinA琼脂陋珠来捕获抗原抗体第介物，4C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温Ih,假如所用抗体为鼠抗或鸡抗.建议加2U1“过渡抗体”（兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG）13 .1400OrPm瞬时离心5s,收集琼脂黠珠-抗原抗体发合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗3逾，800U1./遍,RIPAbuffer有时候会破坏琼尚就珠-抗原抗体织合物内部的结合，可以运用PBS14 .用60hI2X上样缓冲液将琼脂犍珠-抗隙抗体豆合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的须要而定（60足筋上三道）15 .将上样样品煮51nin,以游离抗原，抗体,珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂犍珠，上消也可以短翱冻-20C,留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。RIPABuffer配制：基础成分：TriS-Ha（缓冲液成分，防止蛋白变性）NaC1.（盐份，防止非特异蛋白聚集）NPYO（非离子去污剂,提取蛋白:用H20配制成1假储存液）去班胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白：用H20配制成1.¾储存液；避光保存）留意：打算激陶（致活陶）试验时，不要加去辄胆酸钠，因为高子型去污剂能够使的变性，导致活性丢失。RIPA蛋白的抑制剂茉中基磺酰薇（PMSF）（用异丙酹配制成20（）毗!的储存液，室温保存）EOTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mY的储存液，PH7.4）亮抑薛肽（1.eUPePtin）（用H2O配制成1.mgm1.的储存液，分装，-20C保存）抑蛋白的肽（AProtinin）（用H20配制成1.mgm1.的储存液,分装,-2Oe保存）胃蛋白的抑制剂（PePStatirO（用甲瞭配制成ImgZm1.的储存液,分装，-20C保存）R1.PA磷酸（Si）酹抑制剂激活的Na3VQ1.（用H20配制成200mM的储存液，见SodiumOrthovanadateActivationProtoco）NaF（20OmY的储存液，室温保存）留意：在打狂做磷酸fiH酶试验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制100m1.的modifiedRIPbuffe：1 .称取790InKWTris-Base,加到75m1.去离子水中，加入90Omg的NaC1,搅拌，直到全部溶解,用HC1.调整PH值到7溶2 .加10m1.10%的NP-403 .加2.5m1.10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4 .加1m1.100mM的EDTA,用量筒定容到100m1,2-8'C保存5 .理论上，蛋白梅和磷酸酯的抑制剂应当在运用当天同时加入（抑蛋白酶肽.亮抑的肽,胃蛋白曲抑制剂各1001.;PMSF,Na3V04,NaF各500M1.）,但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应当在运用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中程定5天。各种成分在工作液中的终浓度： Tris-HC1.:50M,pH7.4 NP-40：1% 去氧胆酸钠：0.25% NaC1.:150InM EDTA:1mM PMSI':1mM 抑蛋白酸肽，亮抑菊肽，胃蛋白陶抑制剂：各1gm1. Na3V04:1mM NaF:ImM通过免疫共沉淀确定结合蛋白1.用璘酸盐缓冲液洗30块IOem培育板上的相宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 m1.冰冷的EBC裂解辍冲液中。2 .将每亮升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4C以最大速度离心15min.3 .收集上清（约30m1.）并加入30Hg的适当抗体，IC摇动免疫沉淀物1h.4 .加入0.9m1.的蛋白质A-SePharOSe悬液,4C摇动免疫沉淀物30min.5 .用含90011mo1.1.NaCI的NETN洗蛋白A-SePharoSe混合物，再重纪洗5次。最终，用NETN洗一次.6 .吸出混合物的液体部分。加入800u1.的IXSDS胶加样缓冲液到球球中,煮沸4min。7 .将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度股中，在IOniA的恒定电流下电泳过夜8 .通过考马斯蓝染色视察蛋白质泳带。9 .从胶上切卜.目标带，将其放到微量离心管中，用加150%乙脂洗两次，每次3min.10 .用胰蛋白的消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱.11 .通过窄孔高效液相色谱分别肽。将收集的肽在ABI477A或494.A机器上进行自动Edman降解测序。画