人膀胱逼尿肌中肾上腺素能β3受体基因的克隆及其载体的构建（医学论文）.docx

人膀胱逼尿肌中肾上腺素能3受体基因的克隆及其载体的构建(医学论文)人膀胱通尿肌中肾上腺素能3受体基因的克隆及其载体的构建作者：李听，王平，李刚，刘矗立【关键词】受体;，肾上腺素能3;,载体3ARgenec1.oningfromhumanb1.adderdetrusorsmoothmusc1.eandconstructionofitsantisenseeukaryoticexpressionvectorAbstract】AIM:Toc1.onehumanbeta3adrenoceptor(3AR)genefromhumanb1.adderdetrusorsmoothmusc1.eandconstructitsantisenseeukaryoticexpressionvector.METHODS:The3ARfu1.1.1.engthcDNwasc1.onedandamp1.ifiedfromhumandetrusormusc1.ece1.1.sthroughRTPCR(Bain1.IIandC1.a1.siteswereaddedintothe5endofupstreamprimer,andHindi11intodownstream)andsubc1.onedintoc1.onevector(pUC18).ThetargetgenewasthencutfromC1.aIZHind1.I1.sitesofUC18withrestrictionendonuc1.easeandinsertedinverse1.yintop1.NCXvector.Fina1.1.y,theconstructed3ARgeneantisenseexpressionvectorwasidentifiedthoughrestrictionendonuc1.easeana1.ysisandsequencing.RESU1.TS:Targetgeneofabout1.2kbwassuccessfu1.1.yc1.onedintoretrovira1.vectorp1.NCX.Thesequenceofc1.oned3ARfu1.1.1.engthCDNAwasidentica1.tothereportedoneinGenBank.TheconstructedantisenseeukaryoticexpressionvectorwasprovedtheSamCasdesignedbyrestrictionendonuc1.easeana1.ysisandsequencing.CONC1.USION:3ARfu1.11.engthcDNAwasc1.onedfromhumanb1.addersmoothmusc1.eandtheirantisenseeukaryoticexpressionvectorswereconstructedsuccessfu1.1.y.Keywords)receptors;adrenergic3:vector【摘要】目的：克隆人膀胱逼尿肌中肾上腺素能3受体基因全长，并构建其反义真核表达载体.方法：采纳RTPCR法从人膀胱逼尿肌中扩增出3AR的全长cDN序列,上游引物5端加有BamHI及C1.aI酶切位点,下游引物加有HindIII酣切位点，将该片段插入PUCI8载体中，摇菌扩增后，用C1.aI和HindIII切下目的基因，然后将目的片段反向插入逆转录病毒表达载体P1.NCX上.最终对产生的重组子进行琼脂精凝胶电泳和测序鉴定.结果：经琼脂糖凝胶鉴定，所克隆的目的基因大约为12kb,并胜利地连接到逆转录病毒载体P1.NCX上，经测序证明，插入的目的片段其碱基序列与Genbank上报道的完全一样，且插入载体的方向完全正确.结论：胜利克隆了人逼尿肌中肾上腺素能3受体基因的全长cDNA序列和构建了其反义真核表达载体.【关键词】受体；肾上腺素能3;载体0引言膀胱逼尿肌活动亢进是下尿路症状的常见缘由.探讨发觉，肾上腺素能受体(adrenoceptor,AR)亚型能够介导膀胱平滑肌松弛，对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用1.但何种AR亚型介导逼尿肌松弛，国内外学者还有肯定的争辩2-3.为进一步探讨R亚型在逼尿肌中功能奠定基础，我们拟采纳反义基因(antisense)技术，构建AR亚型的反义真核表达载体，封闭三种AR中的随意两个，得到表达单一亚型的细胞克隆，再进一步进行探讨，以确定AR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，并为找寻新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法供应理论依据.1材料和方法1.1.材料人膀胱逼尿肌标本取自手术中因膀胱癌而行膀胱全切患者标本，取正常组织的膀胱平滑肌约1g,快速放入液氮中10min,再放入-70冰箱中保存.pUC19购于Takara公司：逆转录病毒载体Pncx购自Invitrogen公司:JM109大肠杆菌感受态菌株购自Takara公司.限制性内切酶和DNA工具酶BamIII,HindII1.C1.aI等内切根购于华美生物有限公司；RNase和T4DNA连接的购于Promega公司.Trizo1.试剂及RNA1.PCRTMKit(AW)购自大连宝生物公司；QiAquickGe1.ExtractionKit购于QiagCn公司；质粒提取试剂盒购自Gibco公司.1.2方法1.2.1人膀胱逼尿肌中2AR全长基因的克隆称取冰冻状态下的膀胱逼尿肌组织约200mg,采纳宝生物公司的Trizo1.试剂并按运用说明书操作提取总RNA,10g/1.低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性.根据Genebank提供的3R基因序列(W1.Oooo24)采纳OIigO6.6软件设计如下两对引物，外引物及内引物，应用套式PCR来扩增目的基因.内引物：上游引物FO1.：5CCGGATCCTCGTTGGGGCACCCGGGACGG3,下游引物R01：5GGAGCTTTTCAGCAGTGAGTCA11TG3;外引物：上游引物F02：5TGCGCTTACCTGCCAGACTG3,下游引物R02：5GCCCTTCCTTCTGCTTCTC3.其中内引物是针对蛋白质编码区(CDS:2201461bp)设计的,其上游加有BamH1.及C1.aI酶切位点，下游加有HindIII位点，使其能反向连接在P1.NCX的多克隆位点上.外引物F02,R02可扩增ARcDNA第1941587bp.引物由大连宝生物公司合成取总RNA11.采纳宝生物公司的RN1.APCRTMKi1.(AMV)试剂盒进行RTPCR反应.取81.犷增产物用1%琼脂精凝胶跑电泳，并用BIORADF1.us凝胶图像处理系统进行图像分析.1.2.22AR基因反义真核表达载体的构建PCR产物用10g/1.琼脂糖凝胶跑电泳除杂质，井用柱式PCR产物回收试剂盒回收.回收产物与pUC18克隆载体分别用BamIII和Hind1.n酶切后在T4DNA连接酶的作用下16C过夜连接.取连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,涂布含有氮芳青霉素、IPIG和XgaI的平板，37C过夜培育，挑取白色菌落并作标记，通过菌落PCR鉴定阳性重组克隆.将含有阳性重组质粒的菌落挑入适量1.B培育液中，37°C培育过夜，采纳Gibco公司的质粒提取试剂盒制备质粒，一部分作BamHHHindIII双酶切鉴定正确后将其命名为pUC3AR;一部分用C1.aHHindIII双酶切后，10g/1.琼脂精凝胶回收1.2kb目的基因：随后用C1.aI÷HindI11双醐切逆转录病毒载体p】ncx,并用Qiagen公司的QiAquickGe1.ExtractionKit后回收p1.ncx经酶切后所产生的载体片段，经T4DNA连接梅连接目的基因及载体片段（16C水浴过夜连接），摇菌扩增，提取质粒后，用C1.aRHindIII双酶切进行电泳鉴定.插入片段的碱基序列及其插入方向采纳DA测序方法进行鉴定（由大连宝生物公司鉴定）.鉴定正确后将3AR反义真核表达载体命名为P1.NCX3AR（图1）.2结果2.1目的基因克隆反转录产物经PCR扩增，10g/1.琼脂糖凝胶电泳显示RTPCR结果与预期长度一样（1.2kb,图1）.2.2p1.NCX3AR反义表达载体的酶切鉴定其结果与理论设计完全相符（图2）.1:d12000marker;2：3R:3:阴性比照.图13R目的基因产物的RTPCR检测（略）1:dI2000marker;2rp1.NCX3R;3:空白对照；4:HindIIImarker.图2p1.NCX3R反义表达载体的酶切鉴定（略）2.3p1.NCX3AR载体中目的基因的碱基序列及其插入方向测序结果显示我们所克隆进入P1.ncx的目的片段其碱基序列与Gcnebank所供应的3AR的碱基序列完全一样，且插入方向完全正确，表明我们已经胜利构建了人膀胱逼尿肌肾上腺素能3受体基因的反义真核表达载体：TGGGAAATCAeCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCnATAAG11CTGTTGGCCACTCGGTCCCGCCCTCTGttgatcattcaagagatgatcaacagagttgttgct（测序）.3探讨反义技术是目前很多领域应用得比较多的一种基因治疗技术，其概念就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些基因的表达4.反义技术一般分三种方法：第一种是应用阳离子脂质体将反义的套链核甘酸带入细胞内部，与mRN结合，将其屏蔽掉.其次种是将反义基因（cDN）连接到所需的表达载体（质粒，病毒）上，转染细胞后转录出反义RNA,并与靶mRN互补结合，阻断转录过程，从而最终阻挡蛋臼的表达.第三种是核酶，它是一种具有酶切割活性的反义核酸,与相应的mRN结合后能发挥醯活性将其降解.我们的试验中应用了其次种方法，即应用逆转录病毒载体重组3AR反义RNA,胜利地构建了3R反义RNA的重组逆转录病毒表达载体，以期在基因水平上封闭3AR的表达，来探讨3AR亚型在唠胱逼尿肌松弛过程中的可能价值.在我们的或验中，因为依据相关文献5,3AR无内含子成分，无法针对其中的外显子来构建载体，故此我们选择了以全长的3ARcDNA序列为模板构建载体，来完成封闭作用.B的基因的获得我们是通过RTPCR的方法.在试验的最初我们只是基于3R的蛋白质编码区（CDS）设计了一对引物，并依据p1.ncx和PUC19的多克隆位点在上下游设计了三个的切位点，使其能通过克隆扩增后反向连接到真核表达载体中，应用此对引物进行扩增时，电泳结果在1.4kb处有微弱亮带（目的基因为1.2kb）,且四周有很多杂带存在，将1.4kb泳带切胶回收后，经测序证明不是我们想要的目的基因，分析可能是引物的特异性不高，在3ARmRNA的其他的位置亦有此引物的结合位点所造成的，故此又以5上游及3下游非翻译区为模板设计了一对外用物，先用外引物扩增后，再用带有内切酶的内引物进行扩增，结果得到了1.2kb的单一片段,保证了反应的特异性.肾上腺素能受体分为三种亚型，1,2和3.目前对于肾上腺素能受体的探讨，大多是应用AR亚型选择性的受体激烈剂来探讨其在膀胱松弛过程中的作用6-8,但其选择性依靠于受体激烈剂的特异性，而我们构建AR亚型的反义真核表达载体，转录出反义的AR,从基因水平封闭其亚型的表达,然后用非选择性AR激烈剂处理细胞以消退激烈剂亲和性和效能差异造成的影响，则更加准确.我们选用的真核表达载体P1.NCX是一种逆转录病毒表达载体，相对于脂质体而言，逆转录病毒载体所介导的基因转移效率极高，最高时可达100%,并且可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体中长期表达，可以使我们能有足够的时间来视察在3AR其他两种亚型被抑制之后的膀胱平滑肌的各种生物学特性的变更.而后者往往由于细胞摄入率较低或进入细胞后即被降解而影响其反义抑制效果9.经酶切鉴定和序列分析，本试验所克隆的AR全长CDNA序列与Genbank上报道的完全一样且插入载体的方向也完全正确，重组病毒载体P1.ncxAR经双膈切鉴定，释放出1.2kb的片段，说明AR逆转录病毒反义真核表达载体已构建胜利，这就为下一步AR亚型功能的探讨奠定了基础.【参考文献】1TakedaM,ObaraK,MizusawaT,eta1.Evidenceforbcta3adrenoceptorsubtypesinre1.axationofthehumanurinaryb1.adderdetrusor:ana1.ysisbymo1.ecu1.arbio1.ogica1.andpharmaco1.ogica1.methodsJ.JPharmaco1.ExpTher,1999,288(3):1367-1373.2IgawaY,YamazakiY,TakedaH,eta1.Functiona1.andmoIecu1.orbio1.ogica1.evidenceforapossib1.e3adrenoceptorinthehumandetrusormusc1.eJ.BrJPharmaco1.,1999,126:819825.3RubinsteinR,Sha1.evM,NissenkornI,eta1.Effectofexogenousadenosineanditsmonophosphateonthecontract!Ieresponsetoacety1.cho1.ineinthehumaniso1.ateddetrusormusc1.estripsJJAutonPharmaco1.,1998,18(2):99-104.4ParkJS,ZhangSY,JoSH,eta1.Commonadrenergicreceptorpo1.ymorphismsasnove1.riskfactorsforvasospasticanginaJ.AmHeartJ,2006,151(4):864-869.5JacobG,Gar1.andEM,CostaF,eta1.Bcta2adrenoccptorgenotypeandfunctionaffecthemodynamicprofi1.eheterogeneityinpostura1.tachycardiasyndromeJ.Hypertension,2006,47(3):421-427.6JohnsonM.Mo1.ecu1.armechanismsofbeta(2)adrenergicreceptorfunction,response,andregu1.ationJ.JA1.IergyC1.inImmuno1.,2006,117(1):18-24.7FujimuraT,TamuraK,TsutsumiT,eta1.Expressionandpossib1.efunctiona1.ro1.eof3adrenoceptorinhumanandratdetrusormusc1.eJ.JUro1.,1999,161:680-685.8MoritaT,IizukaH,IwataT,eta1.Functionanddistributionofbeta3adrenoceptorsinrat,rabbitandhumanurinaryb1.adderandexterna1.urethra1.sphincterJ.JSmoothMusc1.eRes,2000,36:21-32.9DuncanVE,AjnumiPS,HughesJA,eta1.Ce1.1.u1.arde1.iveryisamajorobstac1.eforo1.igodeoxynuc1cotideinhibitionofte1.omeraseactivityJ.AnticancerRes,1998,18:4105-4108.