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2024流式细胞术在非造血系统肿瘤诊断和治疗监测中的临床应用进展要点(全文)摘要流式细胞术(FCM)是项集光学、应用流体学、电子学和计算机等多门学科为一体的细胞分析技术。目前，FCM在血液系统肿瘤的诊断与治疗监测中广泛应用，但在非造血系统肿瘤(NHN)的临床应用仍处于初级阶段。近年来，随着分析需求的日益增K和科学技术的发展，一系列与现有高新技术高度整合的新型FCM逐步受到关注，例如质谱流式细胞术(CyTOF).仝光谱流式细胞术(SFC),这些新型FCM的出现为NHN患者临床实验室辅助诊断提供了更多的可能。该文阐述传统FCM、CyTOF与SFC原理及其在NHN诊断和治疗中的应用及前景，为FCM在临床检验的进一步拓展应用提供参考。流式细胞术(f1.owcytometry,FCM)电一项20世纪7。年代发展起来的检测分析技术，目前临床上主要用于血液系统肿痛的诊断和疗效监测。近年来，随着激光器技术的发展、光电倍增管和电刷合装置的革新、聚合荧光染料等新型染料的开发以及质谱流式细胞术，又称飞行质谱流式细胞术(cytometrybytime-of-f1.ight,CyTOF)和全光谱流式细胞术(spectra1.f1.owcytometry,SFC)等新型FCM的研发，FCM不仅实现了多参数检测，其分析灵敏度和分辨率也得到了大幅提升1,2oFCM已开始逐步应用于非血液系统肿瘤疾病，其中对非造血系统肿痛（nonhematopoieticneop1.asms,NHN）的诊断和疗效监测的应用最具发展潜力。NHN起源于造血和淋巴系统以外，是人体恶性肿瘤的主要组成部分3。FCM在NHN诊断和治疗监测中的应用，不仅可提高对肿痢疾病的诊断水平和治疗监测效果，还可为个体化治疗、精准医疗和转化医学的实现提供重要支持，对改善患者生存质量和生存期具有积极意义。一、传统FCM、SFC和CyToF的技术原理传统FCM又称荧光FCM,主要由液流系统、光学系统、检测系统和数据处理系统4个部分组成。SFC是基于传统FCM发展而来的新技术。SFC与传统FCM最大的不同是荧光采集方式。SFC利用散色光学元件（棱镜或衍射光栅）分离发射光，采用检测器阵列（电荷耦合器和多阳极光电倍增管）检测样本发出的全光谱信号，最后利用光谱解析算法获取每个荧光索的完整光谱信号4,5。CyTOF是FCM与元素质谱技术的融合，CyTOF采用金属同位素替代传统的荧光素标记细胞表面分子和内部张白，被标记的细胞以单细胞悬液的形式依次进入等离子体炬进行离子化,随后单细胞形成的离子云进入6行时间质谱,并根据质?-电荷比进行分析和识别，最后将质谱数据转化为标准流式数据对细胞进行定性和定量分析6o二、传统FCM在NHN诊断和治疗监测中的应用（一）传统FCM在NHN诊断中的应用传统FCM检测NHN的样本包括骨髓穿剌、液体活检和组织活检样本。骨髓穿刺和液体活检（血液、脑脊液、胸腹水等）样本中的细胞通常处于悬浮分散状态，适用于FCM分析，因此骨粉穿刺和液体活检样本是传统FCM在实体肿痼检测中最常见样本。组织活检样本主要包括粗细针穿剌和手术切除的活检组织。1 .肿瘤细胞DNA倍体检测:DNA倍体检测是传统FCM展厘应用于NHN诊断和预后评估的检测项目。人体正常体细胞在非分裂状态下DNA含量通常为二倍体，当细胞发生癌变或具有恶性转变的可能时，其发生发展过程可伴随细胞DNA含量异常，表现为多倍体和非整倍体DNA。20世纪80年代,传统FCM就已被用于检测尿道膀胱灌注标本中脱落细胞的DNA含疑以诊断膀胱癌。随后,许多研究表明DNA倍体分析是脱落细胞学恶性细胞诊断的方效辅助检杳7,8O传统FCM精确定量DNA倍体含砧有助于辅助癌前病变和早期癌变的诊断，对于肿瘤治疗后患者的疗效监测和预后评估也才一定意义。2 .肿瘤特异性抗原检测：1：皮来源和非上皮来源的NHN可通过传统FCM检测肿痛细胞上皮细胞抗原表达进行区分。上皮角蛋白（cytokeratin,CK）和上皮细胞黏附分子（epithe1.ia1.ce1.1.adhesionmo1.ecu1.e,EpCAM）是目前传统FCM最常用的上皮来源肿相特异性标志物（表2）。于鑫等9用CK3-6H5（CK抗体复合物）检测了26种人类上皮来源的肿瘤细胞系、3种血液肿痂细胞系以及正常人外周血单个核细胞，结果显示所有的上皮来源肿瘤细胞系均表达CK,阳性率为41.02%9934%,而外周血单个核细胞、淋巴瘤和白血病细胞株均不表达CK。因此CK是个相对灵敏、特异、应用他围较广的上皮肿解标志物,EpCAM又称CD326,除在大多数上皮来源的肿瘤细胞中高表达，还可表达于一些肿瘤T细胞和循环肿痛细胞，EpCAM在间皮细胞和造血细胞上均不表达。Pi1.1.ai等10发现利用FCM检测恶性积液中EpCAM的敏感度和特异度分别为88.15%和97.64%,而单独的细胞学检查敏感度和特异度为73.68%和100%。除CK和EpCAM外,上皮膜抗原、肿瘤相关糖抗原-72、CD15、CDI38、紧密连接蛋臼4等相继被发现是传统FCM鉴定上皮来源肿痛的特异性标志物11,12,13。细胞学检查特异度高但敏感度较低。传统FCM操作简单，高通量，可同时检测多个参数，敏感度较细胞学检查高,对少砧和罕见恶性细胞的检测速度更快。由于正常的骨朝、胸腹水、脑脊液以及淋巴结等样本中不含有上皮细胞，因此传统FCM在恶性积液、骨髓或淋巴结中检测到CK、EpCAM等上皮来源肿瘤特异性标志物时，可作为上皮来源肿瘤发生转移的依据。儿童小圆蓝细胞瘤起源于胚胎间充质和神经外胚层前体细胞，包括神经母细胞瘤、尤文内病、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤等。这些肿瘤细胞因具力.相似的形态学特征而难以区分，传统FCM在这些肿病的诊断和鉴别诊断中发挥着重要作用（表2）。FUrIanettO等14发现传统FCM检测骨能中神经母细胞痛细胞的敏感度为100%,特异度为86%,阳性预测值为67%,阴性预测值为100%。双唾液酸神经节甘脂(disia1.ogang1.ioside2,GD2)在神经母细胞都高表达，是神经母细胞瘤的特异性标志物。GD2也在大部分黑色素痂、部分非小细胞肺癌、视网膜妙细胞痛、尤文肉痛、促结缔组织增生小恻细胞胸中表达15。肌细胞生成素和成肌决定因子1是横纹肌肉瘤的特异性标志物。目前，已彳丁研究团队制定了一个8色/12个抗体组合的实体肿瘤定向管用于快速筛选、定位和分类儿童NHN16o3.白细胞分化抗原检测：由于现有的肿痴特异性标志物并不能的盖所有的NHN,因此在传统FCM分析时常需结合多种臼细胞分化抗原。CD56和CD45是目前最常用的2个标志物。CD56可表达于自然杀伤细胞、恶性浆细胞等造血系统来源细胞，也可表达于小细胞癌和多种神经内分泌肿瘤,如神经母细胞痛。结合NHN通常不表达CD45的特性,临床上常用CD45-CD56+组合来鉴别血液系统肿病与NHN0CD45-CD56+组合指标在神经肌肉来源的NHN中敏感度为100%,上皮来源的肿瘤敏感度为71.5%,而CD56-的NHN主要为非小细胞癌，但这些肿痛细胞一般表达CK或EPCAM12,17。成熟浆细胞的表面标志物为CD138,其在皮肤鳞状细胞癌、结直肠腺癌、胆管癌、肝细胞癌等恶性肿痼中大多呈阳性。因此，在使用CD56、CD45和CD138时，需注意与具有相似表达模式的浆细胞肿瘤等血液系统肿胸进行鉴别。除CD45、CD56以及CD138外，CD81、CD1.0、CD9、CD90、CD99、CD34、CD71、CD57、CD1.17.CD44、CDI5、CD24、CD27KCD58、CD1.Ib等白细胞分化抗原均可参与肿痛细胞鉴定，例如CD45-CD56+CD90+CD81+可见于神经母细胞希1,CD45-CD56+CD90+CD57+/-表达组合最常见于横纹肌肉痴，CD45-CD56+CD99+表型与尤文肉瘤相关。传统FCM可准确区分血液系统肿痛和NHN,对于实体肿瘤的诊断和早期转移侵犯的发现具有重要意义。（二）传统FCM在NHN患者免疫功能评价中的应用免疫力是指机体抵御外来病原体（如细菌、病毒、真曲等），清除异常细胞（如肿耕细胞），维持内环境稳定的能力。肿痛免疫微环境是评价和预测肿瘤免疫疗效的关键指标。目前基于传统FCM已经开展的实体肿痴外周血细胞免疫功能检测项目主要包括T淋巴细胞亚群精细分型、髓源性抑制细胞（mye1.oid-derivedsuppressorce1.1.,MDSC）亚群分析和细胞因子检测二大类18。肿痛患者外周血细胞免废功能检测有助于辅助评价患者免疫功能状态和评估预后、监测免疫检查点抑制剂疗效，以及预防免疫相关不良反应（immune-re1.atedadverseevents,irAE）的发生。1.辅助评价患者免疫功能状态和评估预后：T细胞介导的细胞免疫应答是宿主抗肿瘤免疫的主要途径。目前研究发现，非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌等NHN患者的外周血T细胞的特征表现为CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞以及CD3+CD8+T细胞比例无明显异活,但绝对数降低，旦CD3+CD4+T细胞以及CD3+CD8+T细胞绝对数降低与疾病不良预后呈正相关19,20,21o调节性T细胞(regu1.atoryTce1.1.,Treg)作为免疫抑制细胞，在免疫系统中主要发挥负向调控作用以维持免疫平衡。然而，TrCg在发挥正向保护作用的同时可通过抑制肿物细胞的免疫反应来促进肿瘤生长C多位学者在不同的NHN研究中发现，Treg比例升高与患者的不应预后相关22,23。此外，外周血干细胞样记忆性T细胞、中央记忆T细胞等正向谓节T细胞功能亚群的比例增加与患者的持续临床获益以正相关，而CD8+CD28-T细胞等衰老耗竭细胞亚群的比例升高是不良质后的危险因素。MDSC是种发挥免疫抑制功能的情系来源细胞，可通过抑制CD4+与CD8+T细胞的活化和功能以及驱动和招募Treg细胞等机制抑制免疫细胞的抗肿痛反应。在多种实体瘤中，外周血MDSC比例和绝对值明显升高，且与患者的不良预后相关24,25。细胞因子是介导抗肿痛免疫应答和免疫抑制的重要介质，包括免疫激活因子、免疫抑制因子、促肿痂因子和促炎性因子等。目前已发现的具有抗肿痛活性的细胞因子有白细胞介素(inter1.eukin,I1.)-2、I1.-12、I1.-15、T扰索(interferon,IFN)-和IFN-Y等。免痕抑制性细胞因子主要诱导慢性炎症的持续发生，促进肿痛血管的生成，抑制杀伤性免疫细胞的抑肿瘤效应，其包括I1.-6、I1.-Ip、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)和转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)-B等。外周血中免疫抑制细胞因子(如I1.-6、I1.-8、I1.-IO等)和促肿瘤细胞因子水平与肿鼎的大小、分期、疾病进展等呈正相关，与患者预后呈负相关26,27。2.辅助免疫检查点抑制剂的疗效监测：程序性死亡受体(Programmeddeath,PD)-1是表达于活化T细胞匕的一种跨膜蛋白质，是重要的免疫检查点之一。在肿瘤微环境中，T细胞表达的PD-I与肿痛细胞表达的程序性死亡配体1结合，传递免疫抑制信号，抑制T细胞功能，从而发生肿揄细胞的免疫逃逸。在非小细胞肺癌的研究中，PD-I+CD8+T细胞与PD-I+CD4÷T细胞比例高的患者通常在免疫检杳点抑制剂治疗后具有较好的临床预后28,290传统FCM对肿痴病人外周血T淋巴细胞精细亚群PD-I的检测，有助于监测肿瘤进展情况和PD-I单抗药物的治疗效果，为手术切除、放化疗、靶向治疗等提供参考依据。此外，在NHN患者治疗过程中，T细胞CD38、Ki-67以及人白细胞DR抗原等增殖活化标志物表达增高，MDSC业群和免疫抑制细胞因子、促肿痛细胞因子水平的降低往往提示患者才持续的临床获益和良好预后30,31,32,33o3.辅助监测irAE发生:irAE是免疫治疗过程中常见的并发症“研究发现，黑色素帮患者治疗过程中外周血CD4+记忆效应T细胞比例增高与irAE的发生具有一定的相关性，而基线水平的Treg细胞比例与irAE的发生呈负相关34,35。细胞因子风暴是一种严重的irAE,T细胞过度活化可通过释放IFN-Y和TNFy促使免疫细胞分泌大JKI1.-6,而I1.-6以正反馈调节的形式继续活化T细胞产生多种细胞因子，最终导致多器官功能障碍。三、新型FCM在NHN患者诊断和治疗监测中的应用展望1.新型FCM在NHN件慢穿剌和液体活检中的应用展望：骨愉穿刺和液体活检的样本量有眼，传统FCM由于荧光通道限制，肿瘤细胞鉴定方案常需检测多管样本，导致样本需求版较大CCyTOF与SFC实现了单管对40个以上参数的检测，解决了传统FCM多管分析、流式设门抗体重复添加、检测成本高、圈门困难等问题，大大降低/样本需求量，为稀有样本的有效检测提供可能36,37。Friebe1.等38利用CyTOF绘制脑恶性肿瘤的白细胞图谱，发现脑胶质鼎肿帮微环境主要表现为组织驻留的反应性小胶质细胞，而脑转移病以白细胞为主。他们提出可根据肿痛微环境中组织驻留和入侵的免疫细胞异质性区分胶质痛与脑转移胸，明确肿痛来源的同时结合脑肿病的免疫学特征设计更合理的靶向治疗策略C由于大部分肿瘤缺乏特异性标志物，无法通过传统FCM明确肿痼的具体类型，这是限制FCM推广应用的主要原因之一。有研究人员使用38个抗体组合对基线和I1.a期临床治疗的胰腺癌患者外周血进行分析，发现CD8+CD45RO-CCR7-CD57+和CD14+CD33+CD85j+2个循环免疫细胞亚群与转移性胰腺癌患者的总生存率相关39,证明了新型FCM作为鉴定细胞生物标汜物平台的实用性。此外，对于免疫治疗的患者，CyToF与SFe可更全面地检测评估患者细胞免疫功能状态。综上所述，新型FCM作为单细胞技术的重要蛆成部分，弥补了传统FCM的不足，实现r更高通量检测、更高转化价值的突破，未来也将成为临床检髓诊断中更加强有力的工具。2.新型FCM在NHN组织活检中的应用展望：传统FCM分析时需制备单细胞悬液，对组织活检样本而言，操作复杂。物理分离或懒解消化活体组织的方法不仅影响肿瘤抗原的保存和肿瘤细胞活力，同时也丢失了肿痴样本空间结构与位置信息，限制FCM在实体肿制中的应用。CyToF相关的成像技术为组织活检提供了更多可能，称为成像质谱技术（imagingmasscytometry,IMC）oIMC是质谱技术与免疫细化技术的融合，能够在单组织切片上分析多达40个以上的不同生物标志物，在对肿痛细胞进行亚群划分、肿瘤异质性评估和肿痛细胞功能状态鉴定的同时保留细胞的位置信息40,41oKeren等42对41例三阴性乳腺癌患者进行IMC分析，并根据肿痛组织细胞组成结构，将患者分为混合（肿痛细胞与免疫细胞广泛混合）组和区室化（肿瘤细胞与免疫细胞分区）组，发现个体间肿胸免疫群体组成的可变性以及肿瘤的整体免疫浸涧情况与免疫细胞检查点表达丰度相关，旦区室化组比混合组患者的存活率高。IMC可在空间上精准识别和定好肿痫微环境中不同细胞类型，彳丁助于揭示肿痛微环境的复杂性，理解肿瘤细胞如何在肿瘤微环境中进行浸润、定位和活化，帮助临床筛选治疗受益者和预后评估。此外，通过深入分析肿痛和免疫细胞的空间排布和表型变化，IMC可帮助发现与肿瘤预后相关的免疫相关标志物，为疾病的诊断提供新的标志物以及提供新的治疗靶点,为患者个体化治疗提供更有力的依据。四、问题与思考综上所述，传统FCMxCyTOF与SFC在NHN的诊断和鉴别诊断、疗效监测、揭示肿痛微环境的异质性、发现新的肿痛特异性标志物与疾病相关亚群，寻找潜在治疗靶点等方面均展示出巨大的优势和潜力。虽然CyTOF与SFC相比于传统FCM具有较大优势，但仍有以下不足。1.SFC和CyToF检测和分析的局限性：(1)与CyTOF相比，SFC的通道可用性依然有限，且背景细胞的自发荧光存在干扰光谱解混的可能性C(2)合适的单阳管是SFC光谱解混的关健，否则每个样本均需顶新进行补偿调节。由于具有相似光谱特征的染料有可能引入扩展误差，2种染料的相似性指数需098方可同时使用C因此，SFC分析对染色方案设计的要求较高，旦无论是抗体滴度，还是光电倍增管和/或探测器的变化均会影响SFC的检测结果。(3)CyToF分析时无法进行前向散射光与侧向散射光检测，丢失了细胞大小和细胞内复杂程度的信息C(4)CyTOF还存在采集速度较慢，样品制备要求比传统FCM高、商业标记数或有限等问题。(5)由于多参数和数据结构的更杂性，CyToF与SFC的数据分析更具有挑战性。2.仪器和试剂面临的机遇与挑战：(1)在仪器试剂方面，CyTe)F使用的金属标记抗体与传统FCM、SFC的荧光抗体无法通用，替换成本较高。(2)目前部分荧光抗体和金屈标记抗体均屈于科研抗体，未获得临床使用许可证，导致许多检测项目无法开展，不利用患者的疾病诊断与治疗监测。因此，在未来的临床工作中还需根据实际需求和仪器试剂本身的发展现状选择相应的仪器，简单分析时传统FCM依然具有优势，而对于要求较高的复杂分析，CyTOF与SFC为更优选择。(3)国产化仪器和试剂的快速研发给临床提供了更多选择，更有利于各种FCM在NHN临床实验室诊断中的发展和应用。传统FCM、CyTOF与SFC的推广和应用，是NHN患者早筛、早诊以及疗效监测强有力的工具，未来必定在NHN基础研究和临床应用中大放异彩。