RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）表达的研究.docx

3couldinhibitMYH9expressioninHUVECcelIssuccessfuIyandeffectively,whichpromisediIsfurtherapplicationinrelatedfunctionanalysisofMYH9.【关键词】RNA干扰；人脐静脉内皮细胞(HUVEC);非肌肉肌球蛋白重锌HA(MYH9)非肌肉肌球蛋白重链HA(nonnuscIemyosinheavychainII,NMHCIlA,MYH9)是一种由人第22号染色体上的MYH9基因编码的蛋白，它广泛分布于血管内皮细胞、巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞等多种细胞，与胞质分裂口、肿瘤转移2,3、血小板活化和血栓形成4、血管收缩5等亲密相关。同时，血管内皮细胞在上述生理病理过程中发挥重要作用，但有关MYH9在血管内皮活化中的作用，尚未得到有效阐明。而利用RNA干扰(RMi)技术可以较简洁地制备特定基因缺失表型的个体，表达shRN片段的RNAi载体可以在体内外特异性高效抑制相关基因，便利快捷地探讨该基因的功能6-8。因此，木探讨旨在构建针对人MYH9基因的ShRNA表达载体,筛选出抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)MYH9表达的最佳转染质粒和最佳转染时间，为进一步探讨MYH9的功能供应技术手段，为深化阐释MYII9在血管内皮细胞活化相关的心脑血管疾病、肿痛转移等重大疾病中的作用奠定基础。1材料和方法1.1材料M199培育基、胎牛血清、TRIzok反转录试剂盒均购自GibCO公司。表1MYH9基因的ShRNA序列信息(略)Tab1SequencesofshRNo11!YH9gene1.2.2人脐静脉内皮细胞的分别、鉴定参照文献9方法，分别人脐静脉内皮细胞，以添加200m1.1.胎牛血清，40Um1.肝素，100Um1.青霍素，100mg1.链霉素及ECGS的Ml99培育基，37C、50m1.1.C02细胞培育箱中进行培育。并根据试剂盒说明书的步骤，采纳Wl因子免疫荧光染色、显色，置荧光显微镜下视察鉴定。1. 2.3干扰质粒及比照质粒的细胞转染将第2代HUVEC细胞按3105个/孔接种于6孔细胞培育板中,当细胞80%融合时,参照1.ipofectamine2000转染试剂说明书,按1:2(g1.)比例，分别转染质粒pGCsiMYH91、pGCsiMYH92、pGCsiMYH93以及阴性比照质粒pGCsi.U6neoGFPNON和干扰GAPDII表达的阳性比照质粒GPDHhomo(HlneoGFP),37C解育67h后弃去培育基，用PBS洗涤细胞后，加入含血清和抗生素的M199培育液接着培育。1. 2.4RTPCR检测转染细胞中MYH9mRNA表达转染后24h、48h、72h,分别提取细胞RNA,并用01igo(dT)反转录得cDNA,利用MYH9fllctin特异引物(表2)扩增cDN条带,PCR条件:94C变性30s,55C退火45s,72C延长45s,共30个循环。扩增产物用10g1.琼脂糖凝胶电泳分析，并利用GENEGENUSHindW胸切位点，经BamHI、HindIH双的切后，仅被BanIHl切成线性（图l）图lMYH9shRNA表达质粒的醉切鉴定（略）FiglAGEana1ysisofrecombinantplasmidpGCsiMYHOdigestedwithBamHIandllindlllM:D1.2000DNAmarker:1:MYH9shRNAexpressionplasmid;2:MYH9shRNexpressionpIasmiddigesIedbyBamH1andllind11l;3:UnFecombinantcontroIplasmiddigestedbyBamHIandllindlll.2. 2干扰质粒及比照质粒的转染效率初步检测由于所用的表达质粒带有绿色荧光蛋白（GFP）基因，因此在检测转染细胞MYH9基因mRNA及蛋白表达水平之前，利用荧光显微镜视察各转染组的转染效率（以未转染细胞组为比照），有绿色荧光蛋白表达的细胞阳性率可达80%,表明干扰及比照质粒可大量有效地进入HUVEC细胞（图2）图2重组质粒转染HUVEC细胞后48h的荧光显微镜视察（略）Fig20bservatiOnofHUVECcelIstransfectcdwiIhrccoinbinationpIasmidbyflUorescencemicroscope（48haftertransfection,200）2. 3转染细胞中MYH9基因mRNA表达水平的检测以Actin为内参，半定量RTPCR扩增出MYH9基因特异条带（图3）。光密度扫描结果表明，阴性比照质粒pGCsi.U6neoGFPNON、阳性比照质粒GAPDH/homo（HlneoGFP）、干扰质粒PGCSi