PCR-技术的种类及其应用.docx

PCR技术的片类及其座用IPCR技术的范本原理PCR技术是在模板DNA、引物和时冲dNTP等存在的条件下，依拿于DNA聚合的(Taq苛)的苗促合成反应。其详细反应分三步：交性.退火、聚令。以上三步为一个循环.修一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板,弱小时后，介于替个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经2$一30次循环DNA数量可达2x06'拷贝数.2PeR技术的种类2.1 反向PCR(InVersepCR.IPCR淡术原理：反向PCR是克隆巳知序列旁例序列的一片方法.主要原理是用一片在巳知序列中无切点的隈制性内切片消化基因组DNA.后阵切片段自身环化.以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两堵转异性结合的引物，犷婚夬在中间的未知序列.该犷增产物是鼓性的DNA片段，大小取决于上逑限制性内切酩在已知基闲(WllDNA序列内客的库切位点分布状况,“用不同的限制性内切苗消化,可以得到大小不同的模板DNA.再通过反向PCR获珞未知片段o该方法的不足是：须要从撅多器中选撵IR制将，或者说必需选择一种合适的岳进行解切才能得到合理大小的DNA片段。这种窿择不能在非得切住点切断犯DNA.大多数有核基因组合有大量中度和离度重复序列，而在YAC或COSmid中的未知功能庠列中有时也会有这些序列.这样,通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。2.2 错定PCR(AnChcmdPCR.APCR)技术用用法在一通用引物反转录cDNA3'-末端加上一段巳知序列，线后以此序列为引物结合位点就该CDNA进行犷增.称为APCR.应用：它可用于犷詹未知或全知序列.&未知CDNA的制备及低丰度CDNA文库的构耀.2.3 不对称PCR(asymmetricPCR)枝末两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不我称PCRo在扩堵循环中引入不同的引甥浓度.常用50100÷l比例。在最刈的1015个循环中主要产物迂是双斑DNA,但当低浓度弓I物被消耗尽后,高浓度引甥介导的PCR反应就会产生大量单铢DNA。应用：可$1寄单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针.2.4 反转录PCR(reversetranscriptwn.RT-PCR)技术当扩增模板为RNA聆，等先通过反转京而将其反转录为CDNA才能进行护增。RTPCR应用特别广泛，无论是分子生物学还是临床检转等都常常杲纳.2.5 修饰引物PCR技术为达到某些舞别应用目的，如足阂克隆,定点爽爻、体外转录及序列分析等，可在引物的5,-邛加上峰切位点.突变序列、样录启动子及序列分析结合住点等.2.6 城式PCR(NESTPCR>技术先用一於死序列的外引物扩增以提高槿板*、燃后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带，此为契式PCR。若用一条外引物件内引物则称之为芈臬式PCR,为削减基式PCR的怏作步骤可杵外引物设计得比内引物长些.且用量较少.同时在第一次PCR时采纳较高的退火温度而其次次采纳段低的退火温度.这样在第一次PCR时.由于校高退火理度下内引物不能与横蚊结合.故只有外引物扩增产物，羟过若干次循环.待外引物基本消耗尽，无需取出第一次PCR产物，只密降低退火即可干脆选有PCR犷漕。这不仅削减撰作步骤，同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR杯中送进冬式PCR(drop-in.dropoutPCR),上述三杓方法主要用于极少量DNA懊板的扩增.2.7 等便塞因特异性PCR(AnelC-SPCCifiCPCR.ASPCR)技术ASPeR依靠于引物3-堵的一个或基惜史,不仅削成多聚法的延长效史.而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突交的模板进行PCR扩漕后检测不到虻增产物.可用于检测基因怠央变。2.8 单链构型多态性PCR(SingIeTtrandCOnfOmUUiQnalpolymorphismPCR.SSCPPCR)技术SSCP-PCR是依据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙幅酸屐凝校中的电泳迂珞率变更来检测基因变异.在不含变性剂的中性聚丙笳酸朕裁股中.址里DNA迁移率除与DNA长度有关外.更主要取决于DNA单低所形成的空间构象,相同长度的单强DNA因其候次不同或单个球法差异所形成的构象就会不同.PCR产物经变性后进行耳斑DNA凝胶电泳时.每上单钺处于修定的位置,籍DNA中若发生碱基缺失、插入或单个破基置换时,就会出现泳动变位,从而梃示该片段有墓国变异存在.1.1 9低产R佳特异住引物PCR(1.cwstringencysinglcspecificprimerPC'R.1.SSP-PCR)按术1.SSP-PCR是建立在PCR茶础上的又一种新型基因突变根测技术。要求是“二高一低,*南浓度的单辕引物(5'i3,-窿引物均可Jt约4.81.mOl,高浓度的Taq®(l61.mol100ml),低退火温度(30C).所用的懊板必需是纯化的DNA片段,在这冲低严格条件下.引物与模板何发生不同程度的错配.形成多种大小不同的扩堵产物.姓电泳分别后形成不同的带型.对同一目的茶因而言.所形成的帝里是SJ定的.因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传誓定的快速敏感方法。2.10 X合PCR(multiplexPCR)技术在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,假如基因的某一区段有缺失,则相应的电诙诒上这一区书就会消逝.复合PCR主要用于同一榜奥体的分型及同时检测多种病原体.多个点突交的分子病的诊斫.2.11 重组PCR技术重沮PCR技术是在两个PCR扩落体系中.湾对引物分别由其中之一在其5-i和3、-%引物上帝上一段互补的序列,混合两种PCRir增产物.经受性和复性.两组PCR产物互补序列发生粘连.其中一条重组杂合转能在PCR条件下发生M合延长反应.产生一个包含两个不同基因的杂合基因.2.12 破机引物扩增技术(arbi"aryPrimedPCR.P-PCR)AP-PCR技术逋这地常设计或选择一个丰样异性引物,在PCR反应体系中,苜先在不严格案性下使引物与模板中很多序列通过相比而复性。假如在两击单英上相更肯定更强有反向复性引物存在，则可经Taq籍的作用使引物兔长而发生DNA片段的扩增.经一至数轮不严格条件下的PCR循环后.再于严格条件下进行扩增.犷增的产物维DNA测序凝胶电泳分别后.经放射性自显影或荧光显示即可得到DNA指纹图。APPCR用于肿用的衿制基因、癌法齿的分别；苗种、菌株及不同物种的鉴定；漫件作图：不同分化程度或某些不同状型下的爆绽的基因表达差异等方面的探讨。2.13 型示PCR(differentialPCR.d-PCR)技术d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。言是将目的墓园和一个单指贝的参照基因置于一个试管中进行PCR扩殖.电泳分别后呈两条区带.比权西条区带的丰度.或在引将V-洋标记上放射性核素后,通过检测两条区带放射性罡度即可测出目的基因的拷贝数。2.14 定量PCR(quamilaiivePCR.qPCR)技末qPCR技术是用合成的RNA作为内标来检测PCR/增目的InRNA的量.涉及目的mRNA和内标用相同的引物共同犷增,但扩增出不同大小片段的产物,可简单地电球分别。一种内标可用于定量多种不同目的mRNA.qPCR可用于探讨基因表达.能供应把定DNA基因表达水平的变更.在毋症、代激素乱及由身免疫性疾病的诊断和分析中候省价值。2.15 竞争性PCR(ComPemiVePCR.c-PCR)技术C-PCR技术是克*cDNA模板与目cDNA同时犷增,运用同样的引物,但一经扩增后，能从这些目的CDNA区分开来,通常运用突变性竞争CDNA模板.其序列与目cDNA序列相同.不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点.突变性的CDNA模板可用适当的内切薛水解.并用分光计测定其浓度。CDNA目的序列和竞争横板相对它的台J1.可用淡化乙锭染色,电泳版干魇扫描进行测定,或掺入放射性同位素怀记的方法测定.竞争膜板起先时的浓度是巳知的,则CDNA目的序列外最初浓度就能测定，这种方法能精瑞测定mRNA中CDNA无序列.可用于几个到10个维的中nRNA足量.2.16 半定量PCR(SemiqUantitaliVCPCRsq-RCR)技术sPCR不同于OPCR的是叁照物ERCC-2的PCR产物与目的DNA的PCR产物相像,并分别在试管中小增，sPCR的流程为样品和内参照RNA分别经反转充出cDNA,燃后样品CDNA和一乐列不同it卷熙CDNA分别在不同管进行扩增.PCR产物在琼脂糖凝胶上电冰拍照,光密度讦旧描.作出标准用嵬,通过回来公式便可定量表达的基因量。虽屈管与管之间的扩加效率难以限制,但由PCR扩增的全部样本和参照甥在不同的试验中差异很小.这种敏感的技术可用于其他货表达的基因定IE2.17 匏位PCRTnsituPCR)区末原位PCR亏合了PCR和原位杂交(InSUhybridization.ISH)的优点.是一种在缎投切片或细施涂片上原位对特定的DNA或RNA进行增.再用椅异性的按针原性杂交检测.原位PCR标本一股案先经化学固定,以保持组织为胜的良好形态结构。细胞膜和核膜有肯定的通透性,PCRk堵所常的各柠成分可进入细胞内或核内.在原住有特定的DNA或RNA迸行犷增.丁增产将由于分子较大或相互交织.不易通过细胞膜向外弥散.故保国在原位.这样就很简单应用ISH将其位出.同时还可对目的DNA序列的沮织钮胞独行形态学分析。2.18 免疫PCR(immunoPCR)技术抗原抗体反应与PCR技术的结合产生了免疫PCR.是目前为止最为钝感的检测方法,理论上可测到一个抗原分子的存在,通过用一个具有时DNA和抗体以电站合活性的连接分子,使作为标记物的DNA分子特异地转合到Ag-Ab复合物上，从而形成Ag-Ab-DNA复合物，附着的DNA标记物可用相宜的引构进行PCR扩增，特异性PCR产物的存在证明DNA标记甥分子特异地附着于Ag-Ab复合材上,过而证明有Ag存在。吴科荣等将Abii过化学交秩剂干脆连接到分子上构建成Ab-DNA探针,缎成免枝PCR检测新模式，具有高度灵敏和特异性。免疫PCR可对流行性传染病(如钎炎、爱滋病等)进行总测，也测体液中致您基因和癌基因未达的微量蛋白等.2.19 长片段PCR(Iong-PCR)技术长片段PCR是用高质量模板DNA保证其完整性.引构应较长(214bp),运用高的电火温度及钻Si率更低的的,将无3'5外切厮活性的DNA聚合幅和低浓度有3'-5'外切舞活性的DNA聚合舞组合运用，缓冲体系通过视高TriS的浓度或改用TriCine裳冲液以增加蝮冲实力,并调高体系的pH。热循环参数总的来说需增E延长时向，-ftlkb'min,同时采纳热启动.长片段PCR在限钊性片段多态性及单体型分析、染色体落园步移.DNA序列分析及茶因突变的室定等方面得到应用.3PCR技术的应用3.1 PCR技术在农庄中的应用PCR在转基因产品检测中的应用目前，相关探讨人员已经利用PCR技术胜利建立了检测转基因马铃害、大豆和玉米技术踣途，对转基因大豆和玉米的检测低FR分别到达了1%和0.1%.PCR在探讨生作物生长发育方面的作用植物的生长.发育.分化和苍老都涉及狼多基区的时空依次表达,因此探讨这个过程中基因表达的变更足揭示生长发有机受的正要手段。定量RT-PCR是探讨植物基因表达水平变更的一项曳要技术.通辽探讨不同咳物或同意植物不同发育时期的基因表达水平未为示植物生长发0的机理.3.1.3PCR在作物抗扃性法因分析.定位中拧应用在作物病害探讨中.作物抗病性及其机制探讨始终是当今作物扃理学和作物抗病育种中的热点和焦点何题。而我们现在已经知道作物对病原物的抗性是由相片的基因所限制的.即被广泛认可的基15对基因理论,因此，我寻与作物抗痛性联击连镜的基因标记，即将抗病性基因进行定位的探讨中具有特别重要的理论意义和实践意义.天用PCR和RAPD技术能绯找到与抗住装宝建锁的分子标记,并将其进行定位。3.2 PCR技术在食品杼学中的应历PeR技术在食品科学中主要用于有食品中微生4量的检测，应用PcR技末，只需数小时，就可以用电泳法检测出来SlmgDNA中仅含弱个衿贝的模板序列：用PcR/增沏曲中保守的DNAM-ft,还可对那些人工无法培If的微生物进行般测.3.3 PCR技术在医学中的应用目前.全世界利用PCR技术浮斯感染性疾病每年达几千万人次,可见其巨大的市场君力。PCR技术主要用于肿相.遗传病和感染性痰制的诊断.PCR在肿箱诊断上的任用遣传学变更主要是引起登基因激活和抑福基因的失活,使基因发生突变.缺失、增加和易位等而导致了组胞癌变.PCR不但能有效地检测基因的究变.电排,易住等，而且能精确也测福基IS表达量，可据此进行肿将早期诊断.鉴别、分型、分期.治疗及但后评1等.目前用于肿福检测的PCR主要有定量RT-PCR,它在肿相诊所.治疗和微样移以及微小残留病灶检测等方面具有广泛的应用价值。PCR在遗传病诊断上的应用十几年来,该技术在遗传相诊断的临球应用方面株褥了极大的胜利，如地中诲贫山.食友的、杜氏肌养分不艮立.脑性X综合注.艺丙阴原任等这些澧作桁梆可以送过PCR技术对患青基因进行扩增,然后利用法因分析干胱检测出突变位点.PCR在痘染性疾病方面的应用目前PCR隹医学检验中就感染性疾病的诊断机具突出,只要核酸序列是清新的,跣可以检测到任何有FR的病原体,从而推断疾痛是否处于隐性或正临床状态.视症感染或既往感染.