006第六章-品种真实性及品种纯度测定.docx

第六章品种真实性及品种纯度测定本章讲4节：§1、品种纯度检验的意义§2、种子纯度的形态测定§3、种子纯度的快速测定§4、种子纯度的电泳测定品种真实性(CUltiVargenuineness)和品种纯度(VarietalPUrity)是构成种子质量的两个重要指标，是种子质量评价的重要依据。这两个指标都与品种的遗传基础有关，因此都属于品种的遗传品质。品种纯度检验可分为田间检验、室内检验和小区种植检验3部分。本章主要介绍品种真实性及品种纯度的室内常用测定方法。第一节品种纯度检验的意义一、品种纯度的含义品种纯度检验应包括两方面内容：种子的真实性和品种纯度。在品种纯度检验之前，应先进行种子真实性鉴定，假如种子真实性有问题，品种纯度检验就亳无意义了。1种子的真实性：是指一批种子所属品种、种或属与文件描述(description)是否相符。这是鉴定种子样品的真假问题。2、品种纯度：是指品种个体与个体之间在特征特性方面典型一样的程度，用本品种的种子数(或株、穗数)占供检验本作物样品数的百分率表示。在纯度检验时主要鉴别与本品种不同的异型株(off-typeplant)o异型株:是指1个或多特性状(特征、特性)与原品种的性状明显不同的植株。品种纯度检验的对象:可以是种子、幼苗(Seedling)或植株。因此，品种纯度检验可分为：田间检验、室内检验、田间种植鉴定。三者关系：以田间检验为主，田间检验与室内检验相结合，辅之田间种植鉴定。二、品种纯度检验的意义(了解)1、是保证品种优良遗传特性得以充分发挥的前提探讨表明，玉米种子纯度每降低1%,造成的减产幅度就会接近1%。在杂交稻种子生产中，亲本纯度每降低1%,制种田纯度就会下降67%,粮食生产就会减产10%左右。2、是正确评定种子等级、贯彻优种优价政策的主要依据玉米大田生产一般每穴播2粒：优质种子可单粒播种，如先玉335、郑单958等。3、是防止品种混杂退化，提高种子质量的必要手段品种混杂、品种纯度降低，会明显降低作物产量和品质。品种纯度不高的种子播入田间后会导致作物生长发育不一样、植株高矮不齐、成熟迟早不同。种子纯度降低越多，影响产量的幅度也越大。因此，品种真实性和品种纯度检验在种子生产、加工、贮藏及经营贸易中具有重要意义和应用价值。在生产实践中，由于忽视种子其实性和品种纯度的鉴定，往往给农业生产造成不行弥补的损失。(1)如杂交稻生产中，错把不育系当杂交种播种，造成颗粒无收。(2)刘恩训老师前些年搞玉米不育系育种，挂在墙上被人偷，结果不结粒。(3)若把小白菜(青菜)当作大白菜播种，秋天就不结球。(4)倘如把生长期长的秋大白菜当伏菜种植，会出现因不耐热而染病，且迟迟不能卷心，不能及早上市；反过来，倘如把伏菜当秋菜种植，就会出现早熟、产量低、不耐贮藏。(莱阳二疏把伏菜当秋菜发，培了90万)。(5)若把耐旱小麦品种烟农18种在高肥水地快，会造成倒伏而减产；若把高肥水品种'莱州137'种在旱薄地里，生物产量不够而减产。三、品种纯度检验的方法分类品种纯度检验的方法许多，但在生产中真正能广泛应用的方法较少，没有一个很好的方法。依据测定的原理不同分5类：形态鉴定、物理化学法鉴定、生理生化法鉴定、分子生物学方法鉴定和细胞学方法鉴定。依据检验的方法原理分类，是较为公认的分类体系。还可依据检验的对象分为：种子纯度测定、(实质上是上面的形态鉴定)幼苗纯度测定、植株纯度测定。依据检验的场所分为：田间纯度检验、室内纯度检验田间小区种植检验。在实际应用中，志向的测定方法要达到4个要求：测定结果能重演；方法简洁易行；省时快速；成本低廉。下面介绍依据测定原理区分为5大类：(一)、形态鉴定：又分为：籽粒形态测定、种苗形态测定、植株形态测定。1、籽粒形态测定：仅适合于籽粒较大、籽粒形态较丰富的作物。如玉米种子、大麦；豆类不丰富不能用。时间05h,测定结果受主观影响较大,结果不太精确，只能在调种时大体测定，保证不出大的问题。（玉米父母本差别大易区分）2、种苗形态测定：适用于幼苗形态性状丰富的作物，如十字花科、豆科等双子叶植物，时间一般在730do因苗期用的性状太少，测定结果也不太精确。禾谷类胚芽鞘颜色比较稳定，可鉴别品种纯度。若双亲都是紫色或无色的，则也不精确。如郑单958（郑58X昌7-2）.3、植株形态测定：需一个生长季节26个月，依据的性状较多，测定结果较精确。分为：田间纯度检验和田间小区种植鉴定。但所须要时间较长，不能满意在调种过程中快速测定的须要。（二）物理化学法鉴定（快速法）：分为：物理方法和化学方法。1、物理方法：如荧光鉴定法等，时间10几分钟，仅利用于个别作物，不太精确。2、化学方法：主要依据化学反应所产生的颜色差异区分不同品种，如苯酚染色法、碘化钾染色法等。时间10几分钟一Id,都不太精确。这类方法测定速度快，在实际中有肯定的利用价值。（三）生理生化法鉴定：这类方法中包括的技术较多：1、以生理生化反应为基础的有：愈创木酚染色法、光周期反应鉴定法等。这些方法鉴别品种的实力较低，测定结果不太精确。2、以生理生化技术为基础的方法有：电泳法鉴定、色谱法鉴定、免疫技术鉴定等。（1）电泳技术：相对技术较为简洁，相对较精确地测定品种纯度，是目前品种纯度测定中较为快速精确的方法（二者结合）：同工酶电泳：主要测幼苗，时间17d,比较精确。同工酶的提取须要在低温下进行，操作技术严格，技术麻烦。蛋白质电泳：时间12d,比较精确。蛋白质提取时一般在室温下进行，操作技术简洁。是目前品种纯度测定中较为快速精确的方法。成本低：配套电泳仪50006000元（北京六一仪器厂）一个样品（100粒）药品费6070元。目前500万以上的种子公司都必需配备电泳仪。（2）色谱法技术一技术含量较高：时间12d,辨别率高，结果比较精确，自动化程度高，操作简便，不象电泳技术性强。主要用于禾谷类。仪器构造困难，价格昂贵，成本太高，用不起。此外，电泳板上能同时分析多个样品,而色谱技术每次只能注射一个样品，总体效益不如电泳技术。（3）免疫技术：是个新兴学科，目前须要大量技术开发探讨，难以在生产实际中广泛应用。（四）分子生物学方法鉴定.，方法种类特别多，它是在DNA和RNA等分子水平上鉴别不同品种。目前在品种检测中最常用的分子技术有：RAPD技术、SSR技术。时间l15d,技术比较困难，花费大、时间长。目前主要用于种性测定，测定结果特别精确。因技术困难、成本高，目前难以广泛应用，但有广袤的前景。（五）细胞学方法鉴定主要依据染色体数目和结构变异、染色体带型差异区分种及品种，在品种纯度测定中应用价值不大。综上所述，品种纯度测定的方法特别多，但在生产实际中真正能广泛应用的方法较少。本章主要以国家和国际标准为依据，介绍在品种纯度检验中有着广泛应用价值的方法。其次节种子纯度的形态测定品种纯度检验的送验样品重量：杆样一章已讲过。即试验室测定：玉米等大粒种子1000g；小麦等中粒种子500g；甜菜等小粒种子250g.试验样品：全部方法要求400粒，每重复100粒。种子纯度的形态测定是纯度测定中最基本的方法，可分为籽粒形态测定、幼苗形态测定和植株形态测定。一、籽粒形态测定籽粒形态测定特殊适合于籽粒形态性状丰富、粒型较大的作物。在测定时应留意因环境影响易引起变异的籽粒性状（如甘肃的莱农14、与东北、本地、夏播的颜色不一样）。同时该方法易受主观因素的影响，种子检验员须积累丰富的阅历。这一技术可以与计算机识别相结合对品种纯度进行快速测定，消退主观影响（杨锦忠）。（一）测定方法随机从送验样品中数取400粒种子，每个重复才100粒种子。供检种子数一异品种种子数品种纯度（%）=X100%依据种子的形态特征，逐粒视察区分本品种与异品种，必需备有标准样品。供检种子数测定结果（X）是否符合国家种子质量标准值或标签值（八）要求,可查表61(p86)判别。假如|。-乂2容许差距,说明不符合国家种子质量标准值或标签值要求。如杂交玉米种子纯度的国家标准为96.0%,查表6-1：规定值96%,n=400株时，容许差距为1.6%o抽检结果为94.5%,比规定值低1.5%V1.6%.表明这批玉米种是合格的。表61品种纯度的容许差距(5%显著水平的一尾测定)标准规定值样本株数、苗数或种子粒数50%以上50%以下507510015020040060010009912.31.91.61.31.20.80.70.59823.32.72.31.91.61.20.90.79734.03.32.82.32.01.41.20.99644.63.73.22.62.31.61.31.09555.14.23.62.92.51.81.51.19465.54.53.93.22.82.01.61.29376.04.94.23.43.02.11.71.39286.35.24.53.73.22.21.81.49196.75.54.73.93.32.41.91.590107.05.75.04.03.52.52.01.689117.36.05.24.23.72.62.11.688127.66.25.44.43.82.72.21.787137.96.45.54.53.92.82.31.886148.16.65.74.74.02.92.31.885158.36.85.94.84.23.02.41.984168.67.06.14.94.33.02.51.983178.87.26.25.14.43.12.52.082189.07.36.35.24.53.22.62.081199.27.56.55.34.63.22.62.1表61中的容许差距是怎样计算出来的？可以通过下列公式计算：容许差距T=1.65历而P标准值或标签值；q*100Pn样品的粒数或株数【例1】小麦大田用种的纯度国标为99.0%,试验样品400粒种子，则P=99.0,q=100-99=1.0容许差距T=1.65J99xl/400=0.8例2纯度为90.0%,种植78株，那么P=90,q=10,n=78,则T=5.6特殊适用于试样不是表中的定数时，用上述公式计算容许误差就更便利了。（二）测定所依据的性状种子形态鉴定法最简便、最快速、成本最低而且也较牢靠。缺点是对形态特征差异较小的不同品种很难区分。1、玉米（I）粒形：马齿型、半马齿型、硬粒型。全部的杂交种长出的粮食均排列紧密，一般为马齿型或半马齿型。自交系多数为硬粒型或半马齿型，可把粮食挑出来。（2）粒色深浅：白色,黄色,红色,深红.（糯玉米有白色、黄色、紫色）。大田玉米多数为黄色和红色。主要看籽粒的背面，不要看有胚的一面。（3）程色：从穗轴上带下来的，事实上是穗轴色。分为：白色、粉红色、红色、紫色（简洁分红、白轴）。（4）胚的大小、形态：有的胚较大（478）；有的胚较小（郑58、189）。有的胚光滑（郑58、189、107）；有的有皱褶（黄早4、478）。（5）花丝遗迹的位置与明显程度（花丝着生在籽粒上）：有的看不到，用手才能摸到；位置有的靠边如478系列。有的明显如478系列；有的不明显如H21。（6）依据粒色及籽粒顶部颜色区分自交粒和杂交种：顶部颜色主要由胚乳直感确定，可唯一区分杂交种与自交系。果种皮：由母本确定（2n）：所以粒形杂交种、自交系无区分。另外，杂交种的秤色、花丝遗迹、胚部性状等均由母本基因限制，与自交粒无区分。胚：母本（n）+父本（n）：有杂种优势，但太少，没法区分。胚乳：2n（母）+n（父）：占体积的80%,由胚乳的颜色确定。多数自交系顶部粉质层多，可灵敏区分自交系与杂交种。一类：第深色X&浅色->F粒色和顶部变浅（粉质黄色）（角质白顶）（透亮白顶）典型478系列顶部黄色（粉质），授上父本H21浅色花粉，杂交种顶端表现出父本特征，变成白顶。据此可将母本自交粒与杂交种区分。（隔离不好，传上深色花粉，粒大红色透亮，与粉质自交株有区分。产地不同颜色也有区分）代表品种：掖单2号（107X黄早4）；鲁玉10号（8112XH21）鲁玉16号（478XH21）；莱农14（189×H21）1.D981（齐319义9801）；1.D9006（00-6X9801）9002（郑58乂9801）；中科4号（CT019X9801）山东05年审定19个品种，有5个父本为9801系列。06年审定30个品种，有4个父本为9801系列。07年审定10个品种，有2个H21、1个为9801父本.其次类：孕粒色和顶部为浅色X&粒色和顶部为深色IFl粒色和顶部变深色（自交粒偏浅色）隔离不好也有误差。代表品种：掖单13（478X340）掖单22（488X5237）西玉3号（478X502）第三类：父母本粒色及顶部颜色相近或相同（父母本差别不大一F2粒色无分别）。全国推广面积最大的郑单958（郑58X昌7-2）:母本郑58粒色偏红，父本昌7-2红色，理论上Fl偏红色。但鉴别难度大，把握不准。农大108（178X黄C）：178角质红色X黄C粉质黄色fFl顶部应偏粉质（色变浅），但区分难度大。类似品种有：金海5号（JH78-2×JH3372）;丹玉86（丹988/丹T138）此类品种必需用幼苗鉴定法。有些性状会受到环境条件的影响，如种子的大小、颜色与种子成熟度有关，因此也会影响鉴定的精确性。2、小麦种子：依据粒色深浅：白、红、琥珀色。白度是一个重要指标，粒色白，面粉一般较白。粒形：短柱形、卵圆形、椭圆形、线形。粒形短，一般容重高，出粉率高（一级麦容重790g1.）°烟农15容重高，出粉率高，面白，品质好。椭恻形卵圆形柱形腹而（左）,背面（右）侧面（中上）.横切而（中F）图6-2小麦种子的形态部位质地：角质（透亮度高）：属优质麦：济麦22、烟农19、济南17、洲元9369,适合做面包。粉质（不透亮、白色）：鲁麦21、烟农24、烟2415、烟5158（馒头白，胶东种的多）3、大豆种子：依据粒形：有球形（多数）；扁球形；扁椭圆形等。粒色：黄豆（黄豆多）、青豆、黑豆。脐色：黄、青、淡褐、褐、深褐、黑色（人们喜爱黄色的：豆腐白）脐的形态：圆、椭圆等。大豆种子区分较困难（因圆形多）。4、十字花科：白菜、油菜差别少。籽粒颜色：黄、褐、黑（受成熟度的影响：成熟度差的色浅）。如丰抗70：一亲本黄色，一亲本黑色。则Fl黄：黑=1：1种子大小：如白菜种一般秋菜大，早熟伏菜小。种子形态：球形（鲁白3号）、椭圆形（87TI4）。另外，种脐的形态，脐的大小，胚根在种皮上突起的程度也不同。二、幼苗形态测定随机数取净种子400粒，每个重狂：MOo粒种子。在培育室或温室中可以用100粒，2次重复（GB）.1、禾谷类：（1）主要依据胚芽鞘颜色区分不同品种（大田依据叶鞘颜色）：禾谷类作物胚芽鞘颜色是受遗传基因限制，分为：紫色叮绿色依据这i特征区分不同品种。玉米籽粒颜色深（红色），则胚芽鞘、叶片、叶鞘、花丝、花药颜色都深（正相关）；玉米籽粒黄色，则颜色都浅（绿色）。自交系的胚芽鞘107、178、PI38、昌7-2为紫色（粒色一般偏红）。478、黄C、65232、郑58为绿色（粒色般偏黄）。小麦和水稻也有同样特征，但胚芽鞘（叶鞘）相同的品种或自交系不宜用此法。胚芽鞘绿色胚芽鞘紫色如郑单958用胚芽鞘鉴定较为精确：郑单958（郑58X昌7-2）紫色绿色紫色中科4号用叶鞘鉴定较精确：中科4号(CT019X9801)紫叶鞘绿叶鞘紫叶鞘反之，对于母本为紫色叶鞘，父本为绿色叶鞘的组合以及父、母本叶鞘相同的组合鉴定的精确性则较差(如农大108、金海5号)。（2）依据叶形、叶长、叶色来区分：农大108：抗粗缩病、抗倒、丰产（中国农大：许启风）。178紫鞘X黄C绿鞘一Fl浅紫鞘，自交株与Fl无法区分。采纳标准发芽试验方法视察叶片：母本178：第1叶短，有水纹，12叶缘红色、主叶脉红色。而Fl:l2叶长、绿色；叶缘、主叶脉无红色。（金海5号驻别方法相同）登海3号、丹玉86、金海604等品种视察叶片颜色:P138（叶片紫色）X65232（叶片绿色）一Fl叶片绿色，自交株叶片紫色。此种类型母本粒色深红色，父本黄色，父母本颜色差别比较大。（3）依据发芽速度来鉴定（前提是种子生活力较高）标准25°C发芽试验：发芽盒左边一列放母本作为CK,右边放Fl:Fl一般3d出苗，自交株一般4d出苗。第3天出来的为杂交种；（个别例外）第4天出来的可能为自交株。（4）幼苗鉴定的方法也有规定（同p88）将种子播在砂中，种植密度:玉米、高粱种子间隔1.0义4.5cm；麦粒种子间隔2.0X4.4cm；播深ICm。25培育，24h光照发芽,玉米、高粱14d；小麦7d；燕麦1014d鉴定芽鞘颜色。发芽期间：玉米、高粱每天加水（出苗后）；小麦、燕麦每隔4d加缺磷的HoagIand1号培育液。（缺磷有利于胚芽鞘颜色变深）缺磷的HOagIancl1号培育液配方：每升蒸馈水中加入：2mllmol1.MgSO4（硫酸镁）4mllmol1.Ca（N03）2（硝酸钙）6mllmol1.KNO3（硝酸钾）即2、4、6ml都是lmol1.o种植在土壤里的幼苗可不用缺磷的HoagIand1号培育液，因为土壤里通常含有养分供应。2、大豆把种子播于砂中（播深2.5Cnb间隔2.5X2.5cm）,在25下培育，24h光照，每4d加1次HoagIandl号培育液（不缺磷）。配方：1升蒸储水中加入：Im1.lmol1.KH2PO4（磷酸二氢钾）2m1.lmol1.MgSO4（硫酸镁）5m1.lmol1.Ca（NO3）2（硝酸钙）5m1.lmol1.KNO3（硝酸钾）第1014d后视察幼苗下胚轴颜色；第21d检查茸毛的颜色、茸毛着生角度及小叶形态来区分。3、十字花科将种子播于砂盘内，粒距ICnI,2025C培育。发芽7d后鉴定子叶性状：子叶大小、形态、颜色等进行鉴别。1520d后鉴定真叶性状：据第一真叶形态、大小、叶色、叶脉、叶缘缺刻状况区分。GBp56有药苣、甜菜的幼苗鉴定法（略）第三节种子纯度的快速测定通常把物理法鉴定、化学法鉴定等在短时间内测定种子纯度的方法归为快速测定方法。本节将以国际标准和国家标难为依据介绍部分快速的种子纯度测定。一、苯酚染色法（一）苯酚染色法的机制苯酚染色法已作为ISTA和我国国标（GB）。苯酚染色法的机制有两种观点:一种认为是酶促反应；另一种认为是化学反应。山农大通过各种试验证明，属纯化学反应。该反应受Fe+、Cu+等双价离子催化，可加速反应进行。Na+离子（NaoH、Na2CO3）等对该反应有抑制作用。其反应可用下式表示：苯酚（无色）褐色醍类物质（二）苯酚染色的方法1.麦类（小麦、大麦、燕麦）（DISTA及GB法：水中浸泡1824h-用滤纸吸干表面水分，放入1%苯酚溶液潮湿过的滤纸上（培育皿内：腹沟朝下、胚朝上），室温下保持小麦4h,燕麦2h,大麦24h后，即可鉴定染色深浅。一般小麦染色后的颜色可分5级：不染色、淡褐色、褐色、深褐色和黑色5种。将与基本染色不同的种子取出作为异品种。1%苯酚溶液（将5g结晶石碳酸加入50OnlI蒸馆水），装在棕色瓶里，低温保存。超过3个月，苯酚液不能再运用。（2）快速法：小麦种子用1.0%的苯酚浸15min一取出放在铺有1%苯酚潮湿过的滤纸上（培育皿中：腹沟朝下、胚朝上），盖上贴有同样滤纸的培育皿盖一一置3040C温箱内，染色0.5lh,视察染色结果，区分本品种与异品种。（3）留意问题：按标准规程，制备当地品种的标准色，为了区分品种。视察时不要翻动，比较籽粒间染色的差异。2、水稻：将种子浸泡6h-取出放入1%苯酚溶液室温下12h-f取出用清水洗涤一放在潮湿的滤纸上24h-一视察谷粒或米粒染色程度：谷粒染色分为：不染色、淡茶褐色、茶褐色、黑褐色和黑色5级。米粒染色分为：不染色、淡茶褐色、褐色3级。HUIHIII二、大豆愈创木酚染色法一一特地用于大豆品种鉴别的方法（一）原理：大豆种皮内含有过氧化物酶，不同品种其活性也有差异。过氧化物酶可将过氯化氢分解，放出氧基，游离氧基可使无色的愈创木酚一氧化成红褐色的邻甲氧基对苯醍。HOI一愈创木酚邻甲氧基对苯醍（无色）（红褐色）种皮内的过氧化物酶活性越高，氧化生成的红色物质越多，溶液的颜色越深。不同品种遗传基础不同，过氧化物酶的活性不同，在肯定条件下，溶液染色的深浅不同，依此区分不同品种。（二）方法：逐粒剥下大豆种皮一分别放入小试管中f加Im1.蒸锵水，30浸泡Ihf每支试管中加入10滴0.5%愈创木酚溶液一10min后加入1滴0.1%过氧化氢溶液-Inlin后视察浸出液颜色，依据颜色深浅区分种子。问题：剥种皮时剥的碎，过氧化物酶多，染色较深；剥的完整，过氧化物酶少，染色较浅。克服：最好运用小的打孔器打孔，保证种子之间面积一样。为了克服时间不一样、染色不同,重复粒数适当减小，但总400粒不变。三、荧光分析法一般利用紫外光照耀下发出的荧光不同，产生不同颜色，可鉴别种子的真实性和品种纯度。种子鉴定：取净种子100粒X4次重复，分别排在黑纸上，应用波长为36Onm的紫外分析灯下照耀，置于距紫外光下1015cm,照耀数秒或数分钟后即可视察，依据发出的荧光进行鉴定：如豌豆发出淡蓝或粉红色荧光。白皮燕麦发出淡蓝色荧光；黄皮燕麦发出暗色或褐色荧光。十字花科不同种发出荧光不同：白菜为绿色，萝卜为浅蓝绿色。除以上3种方法外：还有利用NaOH碱液处理区分红白皮小麦；利用KOH-漂白水处理，区分单宁含量不同的高粱品种(详见GB).但这几种方法都不很精确。第四节、种子纯度的电泳测定(与读本一样都是张春庆编)目前室内纯度测定应用最多的是蛋白质电泳法。一、种子纯度电泳测定的发展电泳是指溶液中的带电粒子在电场中移动的现象。这一现象在1927年被人发觉，并用于胶体化学的探讨中。最早用在生物上用于血清蛋白的分析上，直到1961年才用于种子纯度的测定。电泳的种类较多，在生物探讨中，支持物电泳用得最多，特殊是聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):凝胶透亮度高、弹性好、无吸附性、浓度易限制，应用最为广泛。聚丙烯酰胺凝胶电泳又分为圆盘电泳和平板电泳两种：在品种纯度测定中主要应用平板电泳。利用电泳技术进行鉴定品种纯度的探讨较多，至今已对马铃薯、豌豆、菜豆、芸苔属、甜菜、玉米、小麦、大麦、水稻、燕麦、大豆及部分牧草、林木种子进行过探讨。目前鉴定品种的常用电泳方法：1、国际种子检验协会(ISTA)已列入国际种子检验规程3种方法，在全世界推广应用：(1)、鉴定小麦和大麦品种醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳标准程序.同时也被列于国家标准。存在问题：凝胶质量太差，不易操作。提取时间太长（GB为24h,实际1824h）°改进措施：改进提取液（小麦）：70%乙醇，10%尿素。提取时间为34h。（2）鉴定豌豆属的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准方法。（十二烷基磺酸钠）只以分子筛效应分别蛋白质。在玉米品种纯度鉴定方面也有报导，但谱带特异性不强。另外,电泳时间长，染色时间至少24h.0（3）超薄层等电聚焦电泳测定杂交玉米种子纯度的标准方法（仅以分子电荷多少分别蛋白）。等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点的不同来进行分别的，有很高的辨别率。存在问题：等电聚焦电泳所须要的两性电解质价格较贵，成本较高。（进口2000元、国产500元一瓶）2、国内常用电泳方法：（1）我国GB/T3543已将ISTA规程的鉴定小麦和大麦品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照方法列入应用。（2） 2001年农业部颁布了“玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法”（NY/T449-2001）。提取时间和染色时间短，电泳谱带清楚，辨别率高，品种间谱带差异大，组合间互补带明显。但试剂配制比较困难：需分别胶和浓缩胶，且两种胶都用缓冲液配制。（3） 1999年山东省地方标准DB37/T273-1999：AU-PAGE测定技术（醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳）。甘肃省也把该方法作为地方标准。试剂配制比较简洁，样品提取时间和电泳时间短。但谱带弯曲，界限不太清荒。该方法比小麦醇溶蛋白电泳方法更易操作，山东省内种子公司基本用这种方法。二、电泳法测定种子纯度的原理（）遗传基础品种纯度的形态鉴定都是依据器官的大小、颜色和形态等形态进行鉴定。这些形态性状都是遗传基础和环境共同作用的结果，只有在环境条件一样的状况下鉴定品种纯度才较为牢靠。在性状差异较小时，品种纯度鉴定比较困难。目前品种纯度鉴定主要以同工酶和蛋白质为电泳对象。不同品种的遗传基础DNA不同，其转录、翻译而成的蛋白质及同工酶也不同。因此，分析同工酶及蛋白质的差异从本质上说是分析遗传的差异，即品种的差异。利用电泳技术可精确地分析种子蛋白质或同工酶的差异，区分不同品种，测定种子纯度。应当指出：a.同工酶往往具有组织或器官特异性，即同一时期不同器官内同工酶的数目不同（如过氧化物酶同工酶在玉米幼苗中有5种，叶片中有56种，干种子内有2种）。b.此外，同工酶在不同发育时期，数目也不同，所以对种子纯度鉴定不利。C.另外，酶的提取和电泳条件较蛋白质要求严格，须在低温下进行（I（TC以下）。因此，在纯度鉴定的探讨中，应以蛋白质电泳为主。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺通过交联剂（甲叉双丙烯酰胺，BiS）在催化剂的作用下聚合而成的富分子胶状聚合物。变更丙烯酰胺和交联剂的浓度可有效限制凝胶孔径的大小，在品种纯度电泳分析中广泛应用。蛋白质为两性电解质，在不同PH条件下所带电荷多少不同。对某一蛋白质来说，总有一个pH,带正电荷与负电荷多少一样，这个PH叫等电点（pl）。当PH=Pl（等电点）：电荷不移动。pH>pI:碱性条件下，蛋白质将带负电荷。pH<pI:酸性条件下，蛋白质将带正电荷。不同的蛋白质由于氨基酸的组成不同，其等电点Pl也不同，蛋白质在肯定PH下，不同的蛋白质所带电荷不同。在电场中受到的作用力大小有差异。聚丙烯酬胺凝胶电泳主要依据分子筛效应和电荷效应对蛋白质进行分别。1、分子筛效应：由于蛋白质分子的大小、形态不同，在电场作用下通过肯定孔径的凝胶时，受到的阻力大小不同：小分子较易通过；大分子较难通过。随丙烯酰胺和交联剂（BiS）浓度的增加，凝胶孔径变小I,反之孔径变大t。（小孔径凝胶适于小分子蛋白质的分别，大孔径凝胶适于大分子蛋白质的分别。一般分子量110万的蛋白质可用1520%的凝胶；10100万的蛋白质用10%士的凝胶；大于100万的可用<5%凝胶）2、电荷效应：是指蛋白质带的电荷多少不同，受电场的作用力不同，电荷多受到的作用力大，移动较快；反之较慢。溶液的PH与蛋白质的Pl相差越大，蛋白质带电荷越多。经过肯定时间的电泳，性质相同的蛋白质就运动在一起，性质不同的蛋白质就得到了分别。三、种子纯度电泳检测的一般过程（一）品种纯度电泳检测的一般过程：一般包括：药品的配制：样品提取液、凝胶溶液、电极缓冲液样品的提取凝胶的制备加样电泳染色谱带分析六步。1 .样品的提取：不同电泳方法提取液和提取的程序不同，应按详细方法配制提取液和操作。蛋白质有四种：清蛋白：能溶于水。包括大多数酶蛋白。通常可用同工酶电泳方法鉴定。球蛋白：难溶于水，能溶于稀盐溶液；农业部盐溶蛋白电泳鉴定方法就是对球蛋白进行鉴定。醇溶蛋白：不溶于水，但能溶于7080%的乙醇。目前，小麦和大麦种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，就是利用这种蛋白进行电泳鉴定。谷蛋白：不溶于水、醇，可溶于稀酸、稀碱中。2 .凝胶的制备连续电泳只有分别胶（张春庆AU-PEGA；小麦、大麦PAGE电泳）；不连续电泳有分别胶和浓缩胶（农业部盐溶蛋白电泳鉴定方法）。以TEMED（四甲基乙二胺）为催化剂的凝胶系统，温度低于20。C聚合变慢，可将密封好的玻璃板适当预热至30359。样品梳取出后，将槽内残余的溶液用针管吸出。3 .加样电泳加样量应依据提取液中蛋臼质的含量确定，一般1030ul0电泳时一般采纳稳压：玉米、农业部：稳压50OV稳流：省里：稳流85mA一般以凝胶板在电泳时不过热为准。电泳时为了指示电泳的过程，可加入指示剂：（1）对阳离子电泳系统（pH<pl时，酸性电泳）：可用甲基绿作指示剂。点样端接正极，另一端接负极。即上端接正极，下端接负极。（小麦PAGE电泳；张春庆AU-PEGA；农业部盐溶蛋白电泳都是）（2）对阴离子电泳系统（pH>pI时；碱性电泳）用漠酚蓝作指示剂。点样端接负极，另一端接正极。即上端接负极，下端接正极。依据指示剂移动的速度确定电泳时间。4 .染色蛋白质目前用得较多的染色液是10%三氯乙酸（可以1012%）、0.050.1%考马斯亮蓝R-250,该染色液染色后一般不须要脱色。（小麦PAGE：0.05%；张春庆0.08%；农业部0.1%）5 .谱带分析依据蛋白谱带的组成及带型的一样性，区分本品种和异品种。在变性电泳中（蛋白质电泳都是）：杂种Fl表现为双亲共显性：即在父母本中所具有的蛋白质谱带,在Fl代种子内同时出现，没有新的谱带产生。（双亲中有差异的蛋白谱带，同时在B出现，称为互补带）依据互补带的有无区分自交粒和杂交粒。在互补带存在的条件下：（1）假如同时出现了父母本所没有的谱带，可判为亲本不纯。（2）假如互补带的二条有其中一条缺失，则为自交粒。（3）假如整个带型与本品种有很大差异，则为杂粒。杂交辣椒父本、母本及Fl种子蛋白质UT1.IEF电泳图谱.Fl种子皆为真实的杂交种子留意：电泳测定时，不同混杂率状况下，保证测定结果的牢靠性所须要的样本粒数不同（玉米杂交种96%纯度，有100粒即可）。电泳所需样品数量概率水平混杂率0.1151015202530350.994600458904428211613110.9530002985828181310870.90230022845221410865（二）电泳中易出现的问题1 .凝胶不聚合一般凝胶液按比例混合好后，在3040min可以聚合，当Ih以上不聚合，可能由以下缘由：（1）试剂配比不对，应严格按配方进行：可能配方没搞清，细微环节不知道，刊物上说的不细；或配方不合适。（2）凝胶贮液放置时间过长（一周没问题；低温3Od以内）：一般放在棕色瓶内4C保存。但过硫酸氨需现配现用。AU-PAGE催化剂用3.5%过硫酸氨。（3）试剂不纯：特殊是甲叉双丙烯酰胺（Bis、交联剂）应符合化学纯，不能结快，溶解完全。（4）温度偏低：温度V15凝胶聚合变慢。可适当将凝胶放温箱加热。2 .分别胶面不平或凝胶内出现气泡在灌胶后加水盖封时不当心造成的。（农业部配方：用正丁醇盖封）。凝胶内有气泡：灌胶速度太快造成的。因此灌胶和加水盖封时都应当心。3 .电泳过程中出现的故障（1）凝胶龟裂或与玻板分别:主要是电流过大、胶板过热造成的。（2）谱带分别效果不好:即谱带不清楚：配方不成熟；成熟配方做不出来，属药品质量不好,最好用大厂药品，化学纯以上。大分子蛋白质分别不好，凝胶浓度过高（孔太小）。小分子蛋白质分别不好，凝胶浓度过低（孔太大）。电泳时间太短，蛋白质不能很好分别。（3）谱带不整齐：凝胶聚合太快，不均一（催化剂加的太多）。分别胶面不平或凝胶内有气泡造成的。谱带拖尾：原来谱带整齐、细，但出现拖尾。拖尾是样品在电泳过程中分解或变性造成的，应变更样品处理方法。四.小麦、大麦的醇溶蛋白电泳（GB）原理:从种子中提取的醉溶蛋白，可在pH3.2的甘氨酸一一乙酸缓冲液下，以10%聚丙烯酰胺垂直板电泳分别。每粒种子的蛋白图谱，可用于鉴别品种的真实性及纯度。（详细见附件）单粒电动粉碎器磁力搅拌器电泳仪电泳槽离心机五.玉米种子纯度测定的电泳技术（一）醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定法（AU-PAGE）山东省地方标准（DB37/T273-1999）：1、溶液配制1. 1、蛋白质提取液：12InI冰醋酸，18g尿素，加蒸储水溶解，再加4mlTEMED（四甲基已二胺）和0.05g甲基绿加蒸储水至100nll摇匀，低温保存。1.2、 凝胶溶液：IOg丙烯酰胺，IOg尿素，0.2gBis（甲叉双丙烯酰胺），加蒸僧水溶解,加3ml冰醋酸，0.020g硫酸亚铁，定溶至100nI1,摇匀，低温保存。1.3、催化剂溶液：3.5%过硫酸胺溶液，用前现配。1.4、 电极液：1.5%冰醋酸溶液配制1溶On!配1.5、 染色液：0.4g考马斯亮蓝R250,加25ml无水乙醇溶解，加5060g三氯乙酸，加蒸镭水至500mlo2、样品提取：测二次重复，每重复100粒，共200粒种子；假如测定真实性可用100粒。每粒种子用单粒磨粉碎，放入1.5ml离心管中，按样品体积1：1.52加入提取液充分混匀，提取30min,在4000rmp条件下离心4min,取上清液备用。3、制胶：