A型流感病毒对小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCL10的影响及麻杏石甘汤干预作用研究.docx

目的探索麻杏石甘汤（MaXingShiganDeCOCtion,MSD）通过影响小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCLlO表达而防治流感病毒感染的潜在机制。方法通过鼻腔接种法建立A型流感病毒感染小鼠模型，经ig给药或生理盐水3、7d后，计算肺指数和肺指数抑制率，HE染色检测肺组织病理变化，应用免疫组化、酶联免疫吸附试验（ELISA）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测肺组织中CCL5和CXCLlO蛋白和mRNA表达变化，并取小鼠肺组织进行16SrRNA基因V3V4可变区测序、物种注释及聚类，分析AIPha多样性和Beta多样性及组间差异物种，分析CCL5、CXCLIO表达与肺部菌群变化的关系。结果给药3d后，模型组肺指数明显高于对照组（PV0.01）和药物组（PV0.05、0.01）,肺部炎性细胞浸润明显。麻杏石甘汤组肺部炎性细胞浸润明显减轻，肺指数抑制率与奥司他韦组相似，肺损伤的组织学定量评价指标（IQA）值较模型组明显降低（P<0.01）o模型组CCL5和CXCLlO表达明显高于对照组（PV0.0I）,奥司他韦组和麻杏石甘汤组CCL5和CXCLIo表达明显低于模型组（PV0.05、0.01）。16SrRNA基因测序结果显示，模型组拟杆菌属、埃希菌属、变形杆菌属相对丰度增加，粪球菌属相对丰度降低。奥司他韦和麻杏石甘汤能显著降低拟杆菌属、埃希菌属、变形杆菌属相对丰度，增加粪球菌属相对丰度；Alpha多样性分析结果显示各组ACE指数、Chaol指数、ShannOn指数比较P>0.05,组间丰富度和多样性无差异。Beta多样性分析结果显示，给药3d后，组间样品点无交集，组间肺菌群构成有差异。各组间有显著性差异物种。Spearman相关性分析显示，CCL5和CXCLlO表达与埃希菌属、变形杆菌属、拟杆菌属丰度呈正相关，与粪球菌属丰度呈负相关。给药7d后，各组间肺部菌群结构组成及CCL5、CXCLlO表达无显著差异。结论麻杏石甘汤可能通过促进肺部有益菌生长改善肺部微生态环境及免疫微环境，对流感病毒引起的肺损伤有一定的保护作用。流行性感冒（简称流感）是由流感病毒（influenzaviruses）引起的急性呼吸道传染病。根据其核蛋白和基质蛋白不同，流感病毒分为甲（八）、乙（B）、丙（C）、T（D）4型，其中A型流感病毒GnfluenzaAvirus,IAV）是引起人和动物感染的主要病原体1。尽管流感常有自限性，但部分患者会发展成急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征，出现呼吸衰竭和多器官损伤，并最终死亡2。目前，病毒感染所致的“细胞因子风暴”与肺损伤的相关性被普遍认同3。所谓“细胞因子风暴”是指机体免疫系统过度激活引起趋化因子（CC、CXC.C及CX3C家族）和促炎细胞因子（TNF-a、IL-I、IL-6、IL-12、IFN-a、IFN-IFN-y、MCP-I和IL-8等）过度释放，初衷是为了清除病毒，但这种自杀式的攻击，也可能诱导全身性炎症反应，引起多器官功能衰竭，甚至死亡4。研究发现，流感病毒可诱导人和动物体内CCL5（CCCehemokineligand5）和CXCLlO（C-X-CmotifChemokine-10）等趋化因子的产生，CCL5和CXCLlO在甲型流感病毒感染诱导的小鼠急性肺损伤中发挥重要作用5-6。近年来，随着新一代测序技术的应用，肺部微生物群在呼吸系统疾病发生发展中的作用受到关注。谷李铭等网研究发现，流感病毒感染可致肺部微生物群结构和物种多样性发生变化；LlOyd等9研究发现肺部菌群结构与局部炎症反应发生相关；阚亮等10研究发现，肺炎链球菌感染可促进趋化因子CXCLl和CCL5表达，募集免疫细胞至感染部位，促进肺部炎症发生发展。因此，对肺部微生物群的调控可能成为治疗流感病毒性肺炎的新靶点。源自汉代张仲景伤寒论的麻杏石甘汤（MaXingShiganDeCoCtion,MSD）具有辛凉宣肺、清热平喘之功效，主治肺热火盛的肺炎和热邪犯肺的哮喘，广泛用于流感、病毒性肺炎、上呼吸道感染、支气管肺炎等的治疗II。2019年12月以来，新型冠状病毒SARS-CoV-2（severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2）感染肺炎（coronavirusdisease2019,CoVlD-19）疫情在全球爆发，10个月时间，感染人数已超过3千万，波及全球200多个国家和地区12。在国家卫生管理部门发布的系列新型冠状病寿的肺炎诊疗方案及各地方结合区域和人群特点发布的本地区新型冠状病毒的肺炎防治方案中，具有宣肺平喘、祛除寒湿、通腑泻热兼燥湿健脾之效的MSD及其加减方是COVlD-19临床治疗期（中期）被推荐使用频次最高的中药方剂之一13。本课题组前期研究发现，该方具有干预病毒吸附、抑制病毒增殖、抑制宿主细胞凋亡等作用14-16。本研究以流感病毒感染BALB/c小鼠为模型,观察MSD对不同感染时期（急性期和恢复期）小鼠肺部菌群及趋化因子CCL5和CXCLlO表达的影响，以期进一步阐明其防治流感的可能机制,为拓展其临床应用提供新的实验依据。1材料1.1 动物68周BALB/c小鼠50只，体质量（18±2）g,雄性，购于实验动物有限公司许可证号O,动物批号；于中医药大学实验动物中心许可证号饲养。所有实验符合中医药大学动物实验伦理学规定。1.2 病毒株流感病毒小鼠肺适应株（A型，IAV,A/PR/8/34）,由师范大学病毒研究室惠赠。10日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代，血凝效价1:640以上者用于实验。正式试验前根据文献方法17,测定小鼠病毒半数致死量（LD50）,病毒LD50为1X10-3.77,用灭菌生理盐水稀释成每0.1亳升病毒液含50LD50,置于冰袋中备用。1.3 药物与试剂MSD（麻黄9g,杏仁9g,石膏18g,甘草6g）组方药材麻黄（批号）、杏仁（批号）、石膏（碎，棉裹，批号）、甘草（批号），购自中医药大学附属第一医院门诊药房，由中医药大学第一附属医院药学部教授鉴定均为中国药典2015年版收录正品，麻黄为麻黄科植物木贼麻黄EphedraequisetinaBge.的干燥草质茎；杏仁为蔷薇科落叶乔本植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansamaxim的干燥成熟种子；石膏为硫酸盐类矿物硬石膏族石膏，主要化学成分为含水硫酸钙（CaSO42H2O）；甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFiSCh.的干燥根及根茎。磷酸奥司他韦胶囊规格：75mg（以奥司他韦计）X10粒，批号，意大利RocheS.p.A.生产上海罗氏制药有限公司分装购自门诊药房，用蒸播水充分溶解，制成实验用质量浓度为2.165mg/mL的混悬液；抗病毒颗粒（规格：9gX10袋，批号，制药有限公司）购自中医药大学附属第一医院门诊药房，用蒸储水充分溶解,制成实验用质量浓度为039g/mL的溶液。以上实验用药4避光保存备用。兔抗小鼠RANTES抗体（AbCam公司，批号）、CXeLlO多克隆抗体（AbCam公司，批号）、驴抗兔IgG荧光二抗（AbCam公司，批号）、通用二步法试剂盒（生物技术有限公司，批号PV-9000）、小鼠CXCLIO/IP-IoELISA试剂盒（生物科技有限公司，批号）、CCL5/RantesELISA试剂盒（生物科技有限公司，批号）、TRIZOn总RNA提取试剂盒（生物科技有限公司，批号）、HiFiSCriPtCDNA合成试剂盒（生物科技有限公司，批号）、UhraSYBRMiXtUre（生物科技有限公司，批号）、PCR引物由生物工程有限公司合成。1.4 主要仪器BSC-1300IIA2生物安全柜、SW-CJ-IFD超净工作台，空气技术有限公司；TP-200D电子分析天平，天平仪器设备有限公司；RMZI35精密轮转切片机，德国LElCA公司；光学扫描显微镜（AXioSCoPe5）÷Axiocam503color显微镜摄像头，蔡司科技（）有限公司；TGL20M高速冷冻离心机，离心机仪器有限公司；IlluminaMiseq测序仪，美国Illumina公司；ELX-800多功能酶标仪，美国BiO-Tek公司；LighlCyCIer96荧光定量PCR仪，瑞士罗氏公司。2方法2.1 MSD水煎液的制备参照文献方法18-19,采用麻黄先煎方法制备MSD水煎液。按其组成比例分别称量5剂药的药材量。先取麻黄45g,加入药材总量10倍体积的蒸储水，武火煎煮，待沸腾后，调整为文火煎煮25min,去沫，再加入石膏90g、杏仁45g、甘草30g,继续文火煎煮30min,煎煮完毕后滤过；二煎加入7倍体积蒸馅水武火煮沸后再文火煎煮20min,煎煮完毕后滤过，合并2次滤液，水浴浓缩至含生药0.605gmL,40C避光保存备用。2.2 分组与给药实验设对照组、模型组、奥司他韦组（化学药对照组）、抗病毒颗粒组（中药对照组）和MSD组，每组10只小鼠。按临床等效剂量（临床等效剂量按动物每千克体质量占人体表面积的比值计算21）于感染后24h开始ig给药，每天1次，每次0.2mL,连续给药3、7do奥司他韦、抗病毒颗粒、MSD组的给药剂量分别为以奥司他韦计21.63mg（kgd）3.9g（kg-d）,6.05g（kgd）o对照组和模型组均给予ig等量生理盐水。2.3 制备模型实验动物适应性饲养3d后称定质量。除对照组动物外，其余动物按照本课题前期研究方法建立A型流感病毒肺部感染模型20。用乙酸轻度麻醉小鼠后，每只小鼠鼻孔内均匀滴入50LD50流感病毒液0.05mL,建立模型。对照组动物隔离饲养在同等条件下的房间，并按同样方法鼻腔接种0.9%氯化钠溶液0.05mLo2.4 标本采集分别于给药治疗第3、7天，禁水禁食8h后，每组随机选取5只小鼠，称动物体质量后，摘眼球放血法处死小鼠，转移至超净工作台内解剖，称取小鼠肺脏质量，收集部分肺组织置于4%多聚甲醛中固定，用无菌镜子将部分肺组织取下，置于EP管中，冻存于-80冰箱。2.5 检测指标2.5.1 肺指数和肺指数抑制率称小鼠体质量后，取肺脏称定质量，计算肺指数和肺指数抑制率。肺指数=肺脏质量/体质量肺指数抑制率=（模型对照组平均肺指数一给药组平均肺指数）/模型对照组平均肺指数2.5.2 肺组织病理变化苏木素-伊红（HE）染色检测肺组织病理变化。用4%的多聚甲醛固定肺组织、石蜡包埋、切片（45gm）、HE染色后，在光学显微镜下（X400）观察组织病理变化。对肺组织进行病理学评分，每组选6张切片，每张选4个视野（义400）,计数损伤肺泡肺泡内含有红细胞（RBC）或白细胞（WBC）>2个占计数肺泡总数百分比，作为肺损伤的组织学定量评价指标（indexofquantitativeassessment,IQA）253免疫组织化学检测肺组织CCL5、CXCLIO表达PV-9000通用二步法检测各组小鼠肺组织中CCL5、CXCLlO蛋白表达水平。石蜡切片常规脱蜡，水化，抗原修更，内源性过氧化物酶阻断,室温孵育1015min,PBS溶液冲洗,滴加适量CCL5、CXCLIO一抗37孵育60min,阴性对照组用PBS缓冲液代替一抗；PBS溶液冲洗3次后滴加反应增强剂，室温孵育20min；滴加辣根酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育20min；加DAB显色剂处理5min,自来水冲洗，苏木素复染20s,1%盐酸分化，自来水冲洗返蓝；脱水、透明、封片，镜下观察结果。细胞膜和细胞质棕褐色或者棕黄色着色为阳性细胞，以细胞不着色为阴性。用Axiocam503COk）I采集图像，选取结构完整的1张切片，在高倍镜下（X400）,每张切片任选5个视野，应用Image-ProPlus5.0图像分析软件计算每个视野阳性表达的吸光度（八）值，然后求其均值，作为该样本的相对表达量。2.5.4 ELISA法检测肺组织匀浆中CCL5、CXCLlO含量从液氮中取出冻存肺组织标本,标本融化后，剪碎，用标本稀释液将标本充分匀浆（制备成10%匀浆），离心20min（4,2OOOrZmin）,取上清；严格按EUSA试剂盒说明书进行操作，运用酶标仪进行检测。2.5.5 RT-PCR检测肺组织匀浆中CCL5、CXCLlOmRNA表达情况取出液氮中保存的肺组织，按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组样品的总RNAo利用多功能酶标仪检测样品在波长260nm与280nm处的吸光度值A260与A280。选择A260/A280值在1.82.0的样品，用RNaseFreedH20将样品质量浓度调整至500600ngL,逆转录成cDNA,以CDNA做模板，按UltraSYBRMiXUIre试剂说明，分别加入GAPDH、CCL5、CXCLIO引物进行扩增，见表UPCR反应为50L体系，反应体系含cDNA2L,UltraSYBRMixtureCLowROX)25L,10molL上下游引物各1L,以ddH2O补足至50L0反应条件：95IOmin,950CIOs,601min,40个循环，6095绘制熔解曲线。采用2-AACt法计算目的基因相对表达量。表1PCR引物序列Table1Piimersequencesforreal-timeRT-PCR基因名称引物序列(5,3)产物长度ZbpGAPDH-FGGTTGTCrCCTGCGACTTCA183GAPDH-RTggtccagggtttctiactccCCL5-FGTAnTciACACCAGCAGCAAG102CCL5-RTCTGAACCCACTTCTCTCTGCXCLlO-FCAACTGCACCAIACGAGAC147CXCLlO-RGATCCGGATCAGACACTCT2.5.6 16SrRNA基因V3-V4区测序每组2个时间点各选取3个肺组织样本，采用Macherey-NagelKit试剂盒抽提肺组织中的DNA,通过QubitFluorometer对DNA质量浓度进行定量，并通过琼脂糖凝胶电泳对DNA完整性进行评价，DNA质量符合的样本进行文库构建。取30ngDNA样品及融合引物配置PCR反应体系，设置反应参数，对16SrRNA基因V3-V4区进行PCR扩增。引物：341F：5,-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-Sf;806R：5'-GGACTACHVGGGTWTeTAAT-3'。使用AgencourtAMPureXP磁珠进行纯化并溶于ElutionBuffer,贴上标签，文库构建完成。使用AgiIent2100BioanaIyZel检测文库的片段范围及质量浓度，采用InUminaMiSeqPE300高通量测序平台对检测合格的文库进行双末端(Paired-end,PEP测序,获得PEreadSo16SrRNA基因测序分析由医学检验所有限公司高通量实验室完成。2.5.7 生物信息学分析下机数据经过数据过滤,滤除低质量的reads,使用FLASH(FaStLengthAdjustmentofShortreads,vl.2.11)软件，利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads拼接成rawtags；rawtags经进一步去除嵌合体、短序列后得到优质序列CIeantags利用UPARSE软件在97%相似度下将cleantags进行聚类，获得操作分类单元(OPeratiOnaltaxonomicunits,OTUs),通过RDPclassifer软件将OTU代表序列与数据库Greengene比对，得到每个样本的物种分类信息，并在各个水平(phylum、class、order、family、genus、species)进行物种注释。基于聚类结果，进行AlPha多样性分析(ChaOI、Ace>Shannon>Simpson)和Beta多样性分析(non-metricmulti-dimensionalscaling,NMDS法)。采用LEfSeuineardiscriminantanalysis(LDA)effectsize,线性判别式分析分析找到组间在丰度上有差异的物种，结果用LDA值分布柱状图及进化分支图表示，LDAscore(IogIO)>2的物种被认为具有显著性差异，LDA>4可以作为标志物22。2.6 统计学方法采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，实验数据以表示，多组样本间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA）,方差齐时，用LSD进行多重比较，方差不齐采用非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验。两组间比较，对于满足正态性和方差齐性时，采用t检验，方差不齐时用Wilcoxon秩和检验，采用Speannan相关分析进行肺部菌群与肺组织趋化因子CCL5>CXCLlO关联性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2.73.1 肺指数和肺指数抑制率如表2所示，给药3、7d后，各组小鼠肺指数和肺指数抑制率。给药3d后，模型组小鼠肺指数较正常对照组显著升高（P<0.01）;奥司他韦组、抗病毒颗粒组、MSD组肺指数较模型组显著降低（PV0.05、0.01）；给药7d后，模型组小鼠肺指数值较3d时降低，与同期其他各组肺指数比较差异无统计学意义。表2各组小鼠肺指数及肺指数抑制率比较(f±s,w=5)Tabk2Compaiisononlungindexandlungindexinhibirionrateofmiceineachgroup(x±J,w=5)组别剂量/(gkfi)给药3d后给药7d后肺指数肺用数抑制率/%肿指数肺指效抑制率仅对照067±0045一068±003一模型128±024,078±008奥司他韦002163068±0.1147.40068±00813.02抗扁毒颗粒3900078±0.1(F39.330.76±0102.81MSD6050069±0084654O.75±O123.19与对IBifl比较："PVOO1；。粳型组比较：,P<0.05P<0.01<0.01VjMBttolgop;*P'005tP-0.01v：modeleroup3.2 小鼠肺组织病理变化光学显微镜下观察各组小鼠肺组织病理切片，结果见图1。对照组小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔形态完整，肺泡腔轮廓清晰，腔内无分泌物，未见明显炎性细胞浸润。A型流感病毒感染后第4天（给药3d后），模型组小鼠肺泡结构明显破坏，肺泡塌陷甚至消失，肺泡腔内和肺间质中可见大量淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润，组织间可见红细胞渗出，与对照组比较IQA值明显增高（P<0.01,表3）。A型流感病毒感染后第8天（给药7d后），模型组肺组织中仍可见炎性细胞浸润，肺泡壁增厚明显，但与感染后第4天比较，视野中可看到正常肺泡结构，肺泡内炎性细胞浸润减轻，IQA值明显降低，与同期对照组差异无统计学意义（表3）。与模型组比较，给药3d后，奥司他韦组、抗病毒颗粒组和MSD组肺部炎症和损伤程度均有所减轻，以奥司他韦组改善更明显，抗病毒颗粒组和MSD组肺泡壁增厚，肺间质中可见少量炎性细胞浸润，但肺泡腔轮廓较清晰，腔内炎性细胞浸润较轻，各药物组IQA值较模型组明显降低（P<0.05,0.01,表3）。给药7d后，各药物组肺组织结构基本正常，肺泡腔轮廓清晰，肺泡壁较薄，腔内未见明显炎性细胞浸润，与模型组比较，IQA值降低，差异无统计学意义（表3）。上述结果提示，经IAV滴鼻后，能成功建立小鼠流感病毒感染模型，感染第4天时，肺部病变明显，炎症反应较重，感染第8天时炎症反应有所缓解，符合临床急性期和恢复期特征。给予奥司他韦、抗病毒颗粒和MSD治疗3d后，各药物组肺组织病变程度明显减轻。治疗7d后，各组IQA值接近对照组水平。3d后1表3各组小鼠肺组织病理学评分比较(T±5,=5)Table3ComparisonofhistopathologicalSCOreSoflungtissueineachgoup(x±$,7/=5)组别剂量，(gkgT)IQA%给药3d后给药7d后对照14.04÷2.4110.22±2.31模型43.06÷8.4712.65±2.97奥司他韦0.0216318.52±4.22=11.70±2.43抗病毒颗粒3.90021.35±6.03*11.43±1.43MSD6.05017.19±2.4尸10.72±2.03与对照组比较:4P<0.01;与模型组比较：4P<0.0588PVo.01“Pv：0.01Vjcontrolgroup;1iP<0.058P<0.01vsmodelgroup3.3各组小鼠肺组织CCL5、CXCLlO表达由图2、3可知，CCL5和CXCLlO主要表达于炎性细胞和肺泡上皮细胞胞浆和胞膜上。模型组肺组织中可见大量阳性表达细胞,对照组和各药物组小鼠肺组织中也可见少量阳性表达细胞。由表4可知，给药3d后，模型组CCL5和CXCLlO表达较对照组明显增高，差异有统计学意义(PV0.05、0.01),奥司他韦组、MSD组CCL5和CXCLlO表达较模型组明显降低，差异有统计学意义(PV0.05)；抗病毒颗粒组CXeLlO表达较模型对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)o给药7d后，模型对照组CCL5和CXCLIO表达仍高于其它各组，但差异无统计学意义。用IB金型兵可快韦21,63>r"T玩病毒SN3%OMSD605s"r图2CCLS在各组小鼠肺组织中衷达(PV9000通用二步法.X200)Fig.2EspiYssionofCCL5inlungtissueofmiceineMhgroup(iinmunohisrocheuusnyP'-9000v-srepInHhO<1,200)图3CXCLIo在各姐小鼠肪组织中表达(PV9000通用二步法，×200)F.3EXPlsSiOiIofCcL5inlungtissueofmiceineachgroup(UnmunohiscochemisdyPV9000mo-scepmethod.-200)«4各级小锻肺组织中CeL5、CXeLIo的.4值(x±s.w三5)Table4AverageAvaluesoflungtissueofmkeineachgx>up(V±s,w三5)坦别Acoj40KUorJ三<(g,g1)给药3d后给药7d后给药3d后给药7d后对照一0.11±0.020.14±0.02028±0.02O.13±O.O2模3!032±0.03,0.19±0.050.41±003w022±0.11奥司他书0.021630.14±0.020.13±0.01029±0050.14±0.01抗病毒额粒3900O23iO.O5O.12±O.O3032±0090.15±0.01MSD60500.!2±0.01012±0.01O.3O±OO5O.15±OO2MIUttP0.05-PP<0.05"PVOohIjIejBifl比较，少VO.05001VXCoetiolgxo0,tP0.05mod*!grov3.4 各组小鼠肺组织中CCL5、CXCLlO含量ELISA检测结果见表5。给药3d后，模型组小鼠肺组织中CCL5和CXCLIO含量显著高于对照组，差异有统计学意义（P均V0Q1）；奥司他韦组、MSD组肺组织中CCL5和CXCLIO含量明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05,0.01）；抗病毒颗粒组肺组织CXCLIO含量低于模型组（PV0.01）。给药7d后，各组小鼠肺组织中CCL5含量无显著差异；模型组肺组织中CXCLIO含量高于对照组（PVo.05）,奥司他韦组、MSDfflCXCLIO含量低于模型组（P<0.05）o表5各组小蚊肺组织匀桨CcL5和CXaLIo含渊定(F±s,"5)Table5LevekofCCL5andCXCLlOiniun$homo$ena(eofmiceineachgroup(V±S.«5)ffltt剂量(gkgT)-CCL5CXCLlO给为3dJ给药7dJti绘药3d后蛤药7d后对照55132±147.39468.07±77.32225.44±78.(W219.91±73.48模至一828.89±151.55,591.15±63.731058.72±37214,325.W±909奥司他书0.02163589.19±83.53-533.92±49.17402.46±2171-231.67±38.07*抗病毒颗粒3900671.02±118.7552756±49.8451122±26359-264.39±61.04MSD6.050612.07±PS04512J4±23.123M.46±111.05-23659±36.64与j11IRIfl比>VC05-P<OO1;二模!Bifl比我：7><005?<00l”：0.05sp<0.01rifolpm.P<0.05.0.01smodelgwap3.5 各组小鼠肺组织中CCL5、CXCLlOmRNA转录水平比较结果见表6。给药3d后，与对照组比较，模型组CCL5、CXCLlOmRNA表达明显升高（PV0.05、0.01）；与模型组比较，奥司他韦组、抗病毒颗粒组、MSD组CCL5、CXCLlOmRNA表达均明显降低，以奥司他韦组和MSD组下降显著（PV0.01）。给药7d后，模型组CCL5、CXCLIOmRNA表达仍高于其他各组，但差异无统计学意义。表6各组小鼠肺组织CCT5和CXeLIOmR5A相对袤达比较(.v±j,m-5)TaWe6ComparisonofhciveexpressionofCeL5andCXCLlOmR5Ainlungtissueofmkeineachgx>up(V±$.w=5)Ifl别剂量/(gkg)CCL5CXCLlO禽药3d后培药7d后给药3d后饴药7d后对照一1.00±0.231.00±0.021.00±0.051.00±0.04模型972±3.924.22±2.4716.93±4.70w7.41±W奥司他书0.02163435±2.22236±1333.55±15521±1.54抗病毒颗粒3.9005.29±3.>3.48±1544.64±3.174.03±125MSD6.0503W±233*2.16±0.742.57±152*295±1.47p<0.05-P<00l:慢3!tfl比权，*P<0O5*P<00lp005-p<0OlsCXMittolpmtP<0,050OluoxxUl。岬3.6 OUT聚类分析5组2个时间点（给药3、7d）共收集30个肺组织样品（每组每个时间点3个样品），全部建库合格，共获得1696921条原始数据，经过滤严格处理得到I211627条高质量的Tags,平均长度为431bp,以97%相似度聚类，共获得I581个OUT,平均每个样品336个OUT,归属于20个门248个属。3.7 物种分布（微生物群落结构分析）3.7.1 门（Phylum）水平分布结果如图4和表7所示，肺菌群优势菌门以厚壁菌门（Firmicutes）拟杆菌门（BaCterOideteS）和变形菌门（ProteobaCteria）3大菌门为主。给药3d后，对照组、奥司他韦组、抗病毒颗粒组和MSD组厚壁菌门相对丰度较高、其次为拟杆菌门和变形菌门；模型组变形菌门相对丰度较高、其次为厚壁菌门和拟杆菌门。与对照组比较，模型组厚壁菌门相对丰度显著降低（PV0.01）,变形菌门相对丰度增加（PV0.05）；与模型组比较，奥司他韦组、抗病毒颗粒组、MSD组厚壁菌门相对丰度明显增加（PV0.05、0.01）,MSD组变形菌门相对丰度降低（PV0.05）。给药7d后，5组小鼠肺部菌群优势菌门仍以厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门为主，组间各优势菌门相对丰度无显著差异。与给药3d后比较，厚壁菌门相对丰度进一步增加（MSD组略有下降），成为各组占绝对优势的菌门;变形菌门相对丰度增加（模型组略下降），成为各组第2优势菌门。绘为3dK1.00?O-工 O. «桥复给药7d后 LOo«5 奥司他韦 !lSW MSD对 7S50J5 O.O.O.O ttsChhuaydue BKittoSFbcc>ctex H PxobACtnaActxnobactem .0P3 .Fimicvtoi Lectxhe2eIAcxiobjctena5>eOeUaObUSpuochMtesI：Dmboc9m:QimMUDocuWgIenmFibZxtmi.BKtKoC4+Lc三iMi>eGenautHnoaadetejDfmbxtr<mosn>buOdxtiHTMwncuiKCyjoobxttna.SpuoduetesFxxu00P3ClM11>eFobctcuAndoUctKuTM7SRlODlActiBOactehiProecbMna图J给药3、7d后各组样本肺部菌群在门(Phylum)水平上分布Fig.4Disniburionofpulmonafloraa(Phvlumlevelineachgroupon3rdand7thdavofadminisnarion«7各组小限肺部菌群门水平相对丰度(W±s,f=3)Table7RelativeabundanceofpulmouayfloraMphylumlevelinvariousgroups(x±$,-3)组别给药3d后相对书度给药7d后相对M度厚壁常门拟杆菌门变形常门耳堂荫门变形萧门对照70.48±16.9124.18±4292.16±l.ll7812±13.162.60±0.3217J2±12.53模型2988±16.55,2838±9.37.28±21.38,6967±I.552.35±0.5425.43±1.23奥司鲍书54.31±16.99,22.32±7.2320.25±10.807200±0.652.18±0.1823.47±0.52抗病毒颗粒6328±1311,12.40±174119.66±8.55,72.57±2242,12±0.3722.95±1.77MSD8881±8.77-7.31±8.58132±1.0278.87±10.43297±13315.89±11.76与用IR绢比我I*P<0.05"PVOohIJ模里绢比b少VO.05rp<o.oJ><0.05-P<0.01rxcotxvlpup.tP<0.05,P<0.01”model11up3.7.2属水平分布各组小鼠肺菌群优势菌属构成及相对丰度如图5和表8所示。给药3d后，对照组优势菌属包括副拟杆菌属Parabacteroidessp.(9.80%)、颤螺旋菌属OSCinoSPirasp.(5.35%)、MtTiSJBacteroidesCastellaniandChalmers(4.58%)、粪球菌属COPrOCoCCUSHoldemanandMoore(2.21%)、乳杆菌属LaelObaCinUSBeijerinCk(1.28%)等；与对照组比较，模型组拟杆菌属、埃希菌属Escherichiasp.、变形杆菌属PrOteUSSP.相对丰度明显增高(P<0.05>0.01),粪球菌属相对丰度下降(PV0.05)；与模型组比较，奥司他韦组、抗病毒颗粒组、MSD组拟杆菌属和埃希菌属相对丰度显著下降(P<0.01),变形杆菌属相对丰度下降，但不具有统计学意义；与模型组比较，奥司他韦组和MSD组乳杆菌属相对丰度增加(P<0.05)o给药7d后，对照组、模型组、奥司他韦组、抗病毒颗粒组、MSD组小鼠肺部主要优势菌属比较相似，包括厌氧芽胞杆菌属Anoxybacillussp.、芽抱杆菌属Geobacillussp.等，组间优势菌属无显著差异。与给药3d后比较，模型组埃希菌属和变形杆菌属相对丰度下降，但差异不具有显著性水平。伶为7d后Akkenxianua ABOXybACilltn Geobacillas Proteus Pm*otlb Lactobicilhu O±e Mucispinlhim Bacteroidea; Oscillopixa Esehenchu Parabacteroides Acmetobacter Flxiim RUmmoCoeCgHS«natu H CoProeOCCU5 Klebsiella0.500.750.25时照 模型奥司他韦抗病毒额归MSDAcmetob>cter Oscillospira Serratu NovoTphmfobram AqUIbX trmm Thexmus A&oxybaalhis Pseudomonas G<objclhn Lactobacillus Others图5给药3、7d后各组样本肺部南群在属(G÷nus)上分布Fig.5DisniburionofpulmonanfloraatGenusIeVelineachGOUPon3rdand7chdayofadminisuarion*8各组小鼠肺部菌群星水平相对丰度(T±5.”=3)Table8RelativeabundanceofpulmonafloraargenusIeVelineachgoup(X±$.w三3)给药3d后相讨丰度给药7d后相后丰度组用掴杆房用城将Sl属殳形杆图属及球曲属几杆雷星氏乳身抱杆前国芽招杆自国城升国属矢域图后孔杆所属对般455±0550.49±0.330.02±0.032.21±0.89128±0.7928.±24.7415.34±B29028±0.400.11±0.W25.97±442923.04 ±0.89 0.05±0.01 0.03±0.01 0.25±0.2024.17± 014 0 03 ±001 006±0.02 O9±O.12模型13.02±590m18.8!±10.52'13.4S±16.66,023±0.1152±2254L±1.14奥司他韦4.l9